老哥俱乐部

实验报告：

一
、分离与培养：

1
、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min，弃去上清

，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5
、差速贴壁1h后
，吸出培养基
，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2
、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜

；

5
、PBS冲洗细胞3次，每次10min
，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗

， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照
。

细胞简介：

猪心脏瓣膜内皮分离自心脏瓣膜组织
；心脏是脊椎动物身体中重要的一个器官，主要功能是为血液流动提供压力，把血液运行至身体各个部分
。心脏由心肌构成，左心房
、左心室
、右心房
、右心室四个腔组成。左右心房之间和左右心室之间均由间隔隔开，故互不相通，心房与心室之间有瓣膜（房室瓣）
，这些瓣膜使血液只能由心房流入心室，而不能倒流。心脏的作用是推动血液流动，向器官
、组织提供充足的血流量，以供应氧和各种营养物质，并带走代谢的终产物（如二氧化碳、无机盐、尿素和尿酸等），使细胞维持正常的代谢和功能。心脏瓣膜在心脏停止的血液循环活动中扮演的角色即普通又关键：瓣膜相当于门卫，阻止血液回流于刚刚离开的心室

。在心房与心室之间，在心室与离开心室的血管之间，都有瓣膜
。血液流过后，瓣膜就会合上常见的瓣膜问题是二尖瓣脱垂，“二尖瓣"这个词源自“主教冠"，它是主教戴的帽子，有两个尖。位于左心房和左心室之间的瓣膜不能正常闭合
。

方法简介：

公司实验室分离的猪心脏瓣膜内皮采用-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法
、并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来
，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的猪心脏瓣膜内皮经CD31免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1
、HBV
、HCV、支原体、细菌

、酵母和真菌等。

培养信息：

包被条件 PLL（0.1mg/ml）
，明胶（0.1%）

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 内皮细胞样

传代特性 可传2-3代

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象
，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书
，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面
，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清

。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况
，请及时和老哥俱乐部联系

，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1
：2传代 。

9.注意
： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

大鼠细胞周期素D3(CCND3)检测试剂盒

，英文名： CCND3 ELISA Kit

Mouse mammary carcinoma marker-ca153 -CA153ELISA 小鼠癌标志物-CA153检测试剂盒

MouseIerleukin1β,IL-1βELISAKit 小鼠白介素1β(IL-1β)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

HSV-IIIgM单疱疹Ⅱ型病毒IgM(捕获法，二步法)

细胞II型L-3羟酰基-CoA脱氢酶/β淀粉样蛋白结合乙醇脱氢酶(HADHII/ABAD)活性比色法定量检测试剂盒20次

ELISAKitCD44大鼠白细胞分化抗原44

GRN重组人 Granulin / GRN / Progranulin 蛋白 Protein

血管内皮细胞蛋白C受体(PROCR)重组蛋白 Recombinant Protein C Receptor, Endothelial (PROCR)

NA重组甲型流感 H1N1 (A/California/04/2009) 神经酶 (Neuraminidase / NA) (Fc 标签) Protein

EFNA1 Protein Human 重组人 Ephrin-A1 / EFNA1 蛋白

GP140 Protein HIV 重组人类免疫缺陷病毒Ⅰ型 HIV-1 gp140 蛋白 (group M, subtype A, strain 92UG037.1) (Fc 标签)

血管内皮细胞蛋白C受体(PROCR)重组蛋白 Recombinant Protein C Receptor, Endothelial (PROCR)

EFNA1 Protein Human 重组人 Ephrin-A1 / EFNA1 蛋白

GRN重组人 Granulin / GRN / Progranulin 蛋白 Protein

GP140 Protein HIV 重组人类免疫缺陷病毒Ⅰ型 HIV-1 gp140 蛋白 (group M, subtype A, strain 92UG037.1) (Fc 标签)

NA重组甲型流感 H1N1 (A/California/04/2009) 神经酶 (Neuraminidase / NA) (Fc 标签) Protein

小鼠解脲脲原体抗体(UU-Ab)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human papilloma virus aibody (HPV) ELISA Kit 人状瘤病毒抗体(HPV)检测试剂盒

HumanfibromodulinELISAKit 人纤调蛋白(fibromodulin)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

Humanai-cardiolipinaibodyIgA,ACA-IgA检测试剂盒人抗心0脂抗体IgA(ACA-IgA)检测试剂盒规格：96T/48T

植物核同糖1,5二0酸羧化/加氧酶(RUBPCase/Rubisco)羧化活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒20次

Humanα-galactoyl,GalELISAKit人α半乳糖基抗体(Gal)检测试剂盒规格：96T/48T

猪心脏瓣膜内皮细胞小鼠凋亡相关因子(FAS/CD95)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠Slit2ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)ELISAKit   ELISA.   96T/48T