老哥俱乐部

实验报告：

一
、分离与培养
：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置

；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5
、差速贴壁1h后
，吸出培养基
，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定
：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时
，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min
；

2、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在4℃条件下
，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3
、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗
，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜

；

5
、PBS冲洗细胞3次
，每次10min，按1

：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照
。

细胞简介：

小鼠胰腺星状分离自胰腺组织；胰腺分为外分泌腺和内分泌腺两部分。外分泌腺由腺泡和腺管组成，腺泡分泌胰液
，腺管是胰液排出的通道。胰液中含有、原、脂肪酶
、等。胰液通过胰腺管排入十二指肠，有消化蛋白质
、脂肪和糖的作用

。内分泌腺由大小不同的细胞团──胰岛所组成

，胰岛主要由4种细胞组成：α细胞
、β细胞、γ细胞及PP细胞。α细胞分泌胰高血糖素，升高血糖

；β细胞分泌胰岛素
，降低血糖；γ细胞分泌，以旁分泌的方式抑制α、β细胞的分泌
；PP细胞分泌胰多肽，抑制胃肠运动、胰液分泌和胆囊收缩
。纤维化是慢性胰腺炎的典型病理特征，活化的胰腺星状细胞（PSC）是胰腺纤维化的主要效应细胞，PSC分离和成功培养是体外研究胰腺纤维化的重要前提。未活性化的PSC胞浆中富含维A脂滴，并表达Desmin蛋白，活化后的PSC则表达α-平滑肌肌动蛋白（alpha-SMA）。PSC具有静息态与激活态两种

，并分别具有特异的标志物
。静息状态PSC胞质内富含的脂滴可以被油红O染成红色，阳性表达Desmin。激活状态PSC阳性表达alpha-SMA。油红O染色发现，原代分离的细胞培养6d
，胞浆中仍可见明显的脂滴，传代后

，橙红色的脂滴颗粒显著减少甚至消失。免疫细胞化学染色显示，细胞接种24h仍然表达Desmin

，48h后Desmin基本不再表达。培养48h后绝大多数细胞开始表达alpha-SMA，随着培养时间的增长和传代次数的增加，细胞表达alpha-SMA，而不再表达Desmin
，说明细胞活化
。提示PSC接种24h后即启动了激活过程


，至培养第6d大多数细胞激活，传代后细胞处于高度激活状态


。原代胰腺星状细胞可作为慢性胰腺炎新药的细胞筛选模型，目前研究发现
：胰腺受损时，在各种刺激因子作用下使胰腺星状细胞活化
，导致细胞形态
、功能发生变化
，促使基质增生、胶原蛋白的大量生成及不规则沉积
。

方法简介：

公司实验室分离的小鼠胰腺星状采用胶原酶制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶
。

质量检测

公司实验室分离的小鼠胰腺星状经α-SMA、Desmin免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上

，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等
。

培养信息：

培养基 含FBS、生长添加剂
、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 成纤维细胞样

传代特性 可传3-5代左右

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%
；CO2，5%

注意事项
：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液
、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系
。

2. 仔细阅读细胞说明书
，了解细胞相关信息
，如细胞形态
、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面

，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况
，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用
。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

天青B   1g

AzureB   5g

   50KU

Baciacin   250KU

小鼠1,4,5-三0酸肌醇(IP3)试剂盒 96T/48T

Rat cardioophin 1 (CT-1) ELISA Kit 大鼠心肌营养素1(CT-1)试剂盒

Humaeversei-iodothyronine,3ELISAKit 人反三甲状腺原(3)试剂盒 96T/48T 进口分装

HumanC-Polypeptide,CP试剂盒人C多肽(CP)试剂盒规格：96T/48T

组织CSF1R激酶活性定量试剂盒(A/B/C)20次

HumanProteinCELISAKit人蛋白C(ProteinC)试剂盒规格

：96T/48T

GHR重组大鼠 Growth Hormone Receptor / GHR / GHBP 蛋白 Protein

HLA-DR(human leukoyte Antigen DR 0.5mgHLA-DR(human leukoyte Antigen DR) HLA-DR抗原

TFRC重组人 Transferrin Receptor / TFRC / CD71 蛋白 Protein

IFNB1 Protein Human 重组人 Interferon beta / IFN-beta / IFNB 蛋白

IL10RB Protein Mouse 重组小鼠 IL10RB / IL10R2 蛋白 (Fc 标签)

HLA-DR(human leukoyte Antigen DR 0.5mgHLA-DR(human leukoyte Antigen DR) HLA-DR抗原

IFNB1 Protein Human 重组人 Interferon beta / IFN-beta / IFNB 蛋白

GHR重组大鼠 Growth Hormone Receptor / GHR / GHBP 蛋白 Protein

IL10RB Protein Mouse 重组小鼠 IL10RB / IL10R2 蛋白 (Fc 标签)

TFRC重组人 Transferrin Receptor / TFRC / CD71 蛋白 Protein

小鼠胰腺星状细胞大鼠促肾上皮质激素释放激素(CRH)试剂盒
，英文名
： CRH ELISA Kit

Mouse 17 hydroxycoicosteroid (17-OHCS) ELISA Kit 小鼠17羟皮质类固醇(17-OHCS)试剂盒

ELISA 小鼠脑肽(mouse BNP)  进口分装

CLIAKitforLIFELISAKit大鼠白血病抑制因子

通用型HCV(HEPATITISVIRUSC)病毒定量PCR扩增试剂盒20次

ELISAKitAflatoxin霉毒素