實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照。

細胞簡介 ：

小鼠牙周膜成纖維分離自牙周膜組織 ；牙周膜（牙周韌帶 、牙周間隙）是由致密結締組織所構成 。多數纖維排列成束 ，纖維的一端埋於牙骨質內 ，另一端則埋於牙槽窩骨壁裏 ，使牙齒固位於牙槽窩內 ；牙周膜內有神經 、血管、淋巴和上皮細胞等 。成纖維細胞（Fibroblast）是疏鬆結締組織的主要細胞成分 ，由胚胎時期的間充質細胞分化而來 。成纖維細胞較大 ，輪廓清楚 ，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構 ，其細胞核呈規則的卵圓形 ，核仁大而明顯 。成纖維細胞功能活動旺盛 ，細胞質嗜弱堿性 ，具明顯的蛋白質合成和分泌活動 ，在一定條件下 ，它可以實現跟纖維細胞的互相轉化 ；成纖維細胞對不同程度的細胞變性 、壞死和組織缺損的修複有著十分重要的作用 。剛分離的牙周膜成纖維細胞呈圓形 、折光性良好 ，懸浮於培養基中。30min細胞貼壁 ，其中部分開始伸出偽足 ，表現為小的突起 ；6h後細胞基本貼壁 ，伸展成梭形 ，胞核清晰 ，分布較均勻 ，散在生長 ，不聚集成團 ；細胞生長迅速 ，5-7天即呈融合狀態 ，細胞排列緊密 ，有的交叉重疊生長 ，平坦 、胞體較大 ，細胞質透明 ，細胞核較大 ，呈橢圓形 ，顏色淡 。細胞融合 ，並彼此連接成網狀 ；細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布 。牙周膜成纖維細胞（PLFs）作為牙周膜的主體細胞 ，是牙周膜主要的間質細胞 ，它不僅具有合成膠原 、基質 、彈力纖維和糖蛋白的功能 ，還有吸收膠原吞噬異物的能力 ，還參與了牙周組織的病變 、修複及再生過程 。現在 ，利用牙周膜細胞建立體外模型 ，已經成為有關員研究牙周組織疾病的重要手段 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的小鼠牙周膜成纖維采用膠原酶-聯合消化法製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的小鼠牙周膜成纖維經Vimentin免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

培養基 含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 成纖維細胞樣

傳代特性 可傳3代左右

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

小鼠胰島素樣生長因子1(IGF-1)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠白介素10(IL-10)ELISAKIT   ELISA.   96T/48T

小鼠白介素11(IL-11)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

中文名稱   方法   規格

小鼠血管生成素4(ANG-4)ELISA 試劑盒 96T/48T

Rat secretory immunoglobulin A (sIgA) ELISA Kit 大鼠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)試劑盒

HumanCholicacidELISAKit 人膽酸(Cholicacid)試劑盒 96T/48T 進口分裝

rabbitTissue-typePlasiminogenActilyse,t-PA試劑盒兔子組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)試劑盒規格 ：96T/48T

油類高效液相色譜法定量試劑盒20次

MouseIerferonγ,IFN-γELISAKitKit小鼠γ幹擾素(IFN-γ)試劑盒規格 ：96T/48T

POSTN重組人 Periosestin / POSTN 蛋白 Protein

胰島素樣生長因子2(IGF2)重組蛋白 Recombinant Insulin Like Growth Factor 2 (IGF2)

NA重組甲型流感 H5N1 神經酶 (Neuraminidase / NA) (高活性) Protein

CD40 Protein Human 重組人 CD40 / TNFRSF5 蛋白

FLAA Protein M.viridifaciens 重組單核細胞增生李斯特菌 flagellin / flaA 蛋白

胰島素樣生長因子2(IGF2)重組蛋白 Recombinant Insulin Like Growth Factor 2 (IGF2)

CD40 Protein Human 重組人 CD40 / TNFRSF5 蛋白

POSTN重組人 Periosestin / POSTN 蛋白 Protein

FLAA Protein M.viridifaciens 重組單核細胞增生李斯特菌 flagellin / flaA 蛋白

NA重組甲型流感 H5N1 神經酶 (Neuraminidase / NA) (高活性) Protein

小鼠牙周膜成纖維細胞大鼠單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)試劑盒  ，英文名 ： MCP-1 ELISA Kit

Porcine apolipoprotein B100 (apo-B100) ELISA Kit 豬載脂蛋白B100(apo-B100)試劑盒

ELISA 小鼠抗利尿激素/血管加壓素(mouse AVP/ADH)  進口分裝

CLIAKitforLPAb-IgA(HumanLegionellaaibodyIgA)ELISAKit人軍團菌抗體IgA

通用型DNA克隆試劑盒(不包括內切酶)10次

ELISAKitIL-1雞白介素1