老哥俱乐部

实验报告：

一
、分离与培养：

1
、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液
，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化
；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min

，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ 
，5％CO2 培养箱中培养；

5
、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定
：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时
，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在4℃条件下
，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min

，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜

；

5、PBS冲洗细胞3次
，每次10min，按1
：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

兔骨髓树突状分离自骨髓；骨髓是机体的造血组织，位于身体的许多骨骼内
。成年动物的骨髓分两种
：红骨髓和黄骨髓。红骨髓能制造红细胞
、血小板和各种白细胞。血小板有止血作用，白细胞能杀灭与抑制各种病原体，包括细菌、病毒等
；某些淋巴细胞能制造抗体。因此
，骨髓不但是造血器官
，它还是重要的免疫器官
。骨髓是存在于长骨（如肱骨
、股骨）的骨髓腔和扁平骨（如髂骨）的稀松骨质间的网眼中
，是一种海绵状的组织
，能产生血细胞的骨髓略呈红色，称为红骨髓。出生时，红骨髓充满全身骨髓腔，随着年龄增大，脂肪细胞增多
，相当部分红骨髓被黄骨髓取代
，后几乎只有扁平骨骨髓腔中有红骨髓

。骨髓DC细胞是由骨髓单核细胞诱导而成的；树突状细胞分为成熟树突状细胞和未成熟树突状细胞，典型的未成熟树突状细胞呈半贴壁生长，在GM-CSF、IL4的作用下形成葡萄串样集落，细胞大而形态不规则，表面皱褶多，亦可见少量短刺状突，胞内细胞器丰富并可见吞噬泡，具有较强的迁移能力，伴随有部分未诱导成的单核细胞，贴壁形态多样
。而成熟的树突状细胞由未成熟DC进一步经TNFα、LPS等诱导而成
，多数呈悬浮生长， 细胞呈圆形，细胞体积进一步增大，表面大量粗细不等的树枝样突起（高倍镜或者电镜下可观察到 ），伴随少量贴壁未成熟细胞或者单核细胞。未成熟DC细胞长时间培养也可能导致自发分化成熟。DC细胞尚无特异性细胞表面分子标志，主要通过形态学、组合性细胞表面标志

、在混合淋巴细胞反应中能激活初始T细胞等特征进行鉴定。其中成熟树突状细胞表面高表达主要组织相容性复合物（MHC）以及CD80、CD86等共刺激分子，进而激活T淋巴细胞
，诱导免疫应答，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节；未成熟树突状细胞具有很强的抗原摄取加工能力


，但由于缺乏多种共刺激分子不能使初始T细胞活化
、增殖产生免疫应答，不能激活T细胞的信号
，可导致T细胞无能
，从而诱导免疫低反应或抗原免疫特异性耐受。未成熟树突状细胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ类分子等共刺激分子表达较低，一般在30%以下。

方法简介：

实验室分离的兔骨髓未成熟DC采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞、培养过程添加细胞因子诱导而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

实验室分离的兔骨髓树突状(未成熟DC细胞)经CD86免疫荧光鉴定、细胞形态等综合鉴定，纯度可达80%以上
，且不含有HIV-1、HBV、HCV
、支原体、细菌、酵母和真菌等
。

培养信息：

培养基

：含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率
：每2-3天换液一次

生长特性
：半贴壁半悬浮

细胞形态
：圆形、梭形、多角形，形态多样

传代特性
：属于高度分化细胞

；属于不增殖细胞群

消化液：0.25%

培养条件：气相
：空气，95%；CO2
，5%

兔骨髓树突状(未成熟DC细胞)体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的佳培养状态
。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液
、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系
。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基

、血清比例
、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞

，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系
，告知细胞的具体情况
，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

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