老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养
：

1、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小
；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置
，重复此步骤2-3次
，直至组织被消化
；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清

，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养
；

5、差速贴壁1h后
，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养
；二、免疫荧光鉴定：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min

，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min
；

2、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h
；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介

：

人牙周膜成纤维分离自牙周膜组织
；牙周膜（牙周韧带
、牙周间隙）是由致密结缔组织所构成。多数纤维排列成束，纤维的一端埋于牙骨质内，另一端则埋于牙槽窝骨壁里
，使牙齿固位于牙槽窝内；牙周膜内有神经、血管
、淋巴和上皮细胞等
。成纤维细胞（Fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来
。成纤维细胞较大

，轮廓清楚

，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构


，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动

，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化

；成纤维细胞对不同程度的细胞变性
、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用。刚分离的牙周膜成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁，伸展成梭形，胞核清晰
，分布较均匀
，散在生长，不聚集成团；细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态

，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦

、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形
，颜色淡
。细胞融合，并彼此连接成网状；细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。牙周膜成纤维细胞（PLFs）作为牙周膜的主体细胞，是牙周膜主要的间质细胞，它不仅具有合成胶原
、基质

、弹力纤维和糖蛋白的功能

，还有吸收胶原吞噬异物的能力，还参与了牙周组织的病变
、修复及再生过程。现在
，利用牙周膜细胞建立体外模型，已经成为有关员研究牙周组织疾病的重要手段
。

方法简介
：

公司实验室分离的人牙周膜成纤维采用胶原酶-联合消化法制备而来
，细胞总量约为5×10?cells/瓶
。

质量检测

公司实验室分离的人牙周膜成纤维经Vimentin免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1
、HBV、HCV、支原体
、细菌、酵母和真菌等。

培养信息
：

培养基 含FBS、生长添加剂


、Penicillin

、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 成纤维细胞样

传代特性 可传5代左右
；3代以内状态佳

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气

，95%
；CO2，5%

注意事项
：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液
、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系
。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态

、所用培养基
、血清比例、所需细胞因子等

，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片
，是正常现象

。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化


，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞
，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养

。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因

，个别敏感细胞会出现不稳定的情况
，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞
。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意
： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

小鼠神经营养素4   英文名称
：   Neuroophin-4   规格

：      英文缩写：   -4

小鼠神经酸酶   英文名称：   Mouse Neidase   规格：      英文缩写
：   NEU

小鼠8羟基脱氧鸟苷   英文名称
：   Mouse 8-hydroxy-2'-desoxyguanosine   规格
：      英文缩写：   8-OHDG

小鼠嗅素4   英文名称
：   Mouse Olfactomedin 4   规格：      英文缩写：   OLFM4

小鼠双氢睾酮(DHT)ELISA 试剂盒 96T/48T

Measles virus (MV) ELISA Kit 人麻疹病毒(MV)试剂盒

Humansolublemyosinheavychain1,sMHC-1ELISAKit 人可溶性肌球蛋白重链1(sMHC-1)试剂盒 96T/48T 进口分装

DuckIerleukin6,IL-6试剂盒鸭白介素6(IL-6)试剂盒规格：96T/48T

枣椰树(datepalm)培养基500毫升溶液/片剂

MouseDehydroepiandrosteroneS7,DHEA-S7ELISAKit小鼠脱氢表雄同S7(DHEA-S7)试剂盒规格
：96T/48T

IL1B重组大鼠 IL-1 beta / IL1B 蛋白 (pro form, His 标签) Protein

HO-2(Heme oxygenase 2 0.5mgHO-2(Heme oxygenase 2) 血红素氧合酶-2抗原

SGK3重组人 SGK3 / SGKL 蛋白 (His & GST 标签) Protein

CLEC6A Protein Human 重组人 CLEC4N / CLEC6A / Dectin-2 蛋白 (Fc 标签)

IL1R1 Protein Mouse 重组小鼠 IL1R1 / CD121a 蛋白

HO-2(Heme oxygenase 2 0.5mgHO-2(Heme oxygenase 2) 血红素氧合酶-2抗原

CLEC6A Protein Human 重组人 CLEC4N / CLEC6A / Dectin-2 蛋白 (Fc 标签)

IL1B重组大鼠 IL-1 beta / IL1B 蛋白 (pro form, His 标签) Protein

IL1R1 Protein Mouse 重组小鼠 IL1R1 / CD121a 蛋白

SGK3重组人 SGK3 / SGKL 蛋白 (His & GST 标签) Protein

人牙周膜成纤维细胞大鼠热休克转录因子4(HSF4)试剂盒 ，英文名
： HSF4 ELISA Kit

Mouse vascular endothelial cell growth factor B (VEGF-B) ELISA Kit 小鼠血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)试剂盒

RatAquaporin1,AQP-1ELISAKit 大鼠水通道蛋白1(AQP-1)试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforGuineapigovalbuminspecificIgG,OVAsIgGELISAKit豚鼠卵清蛋白特异性IgG

细胞长链脂酰合成酶(ACYLCOASYHETASE)活性酶连续循环比色法定量试剂盒20次

Ratulasensitivethyroid-stimulatinghormone,U-TSHELISAKit大鼠高灵敏度促甲状腺激素(U-TSH)试剂盒规格：96T/48T