老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养：

1

、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2
、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液
，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化

；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清
，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶

，放置于37℃
，5％CO2 培养箱中培养
；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基
，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次

，每次10min

，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min
；

2
、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min；

4
、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗

， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照


。

细胞简介：

人外周血淋巴分离自外周血
；外周血是除骨髓之外的血液
，临床上常用一些方法把骨髓中的造血干细胞释放到血液中，再在从血液中提取分离得到造血干细胞
，老哥俱乐部把这样得到的干细胞称为外周血干细胞，在二十一世纪初人类开始的生命方舟计划中提出外周血这一新概念。淋巴细胞（lymphocyte）是白细胞的一种
，是体积小的白细胞。其由淋巴器官产生，主要存在于淋巴管中循环的淋巴液中，是机体免疫应答功能的重要细胞成分
，是淋巴系统几乎全部免疫功能的主要执行者
，是对抗外界感染和监控体内细胞变异的一线“士兵"。淋巴细胞是一类具有免疫识别功能的细胞系，按其发生迁移、表面分子和功能的不同
，可分为T淋巴细胞（又名T细胞）、B淋巴细胞（又名B细胞）和自然杀伤（NK）细胞。T细胞和B细胞都是抗原特异性淋巴细胞，它们的初来源是相同的
，都来自造血组织。T淋巴细胞随血循环到
，在激素等的作用下成熟，而B细胞在骨髓中分化成熟。当受抗原刺激后
，T淋巴细胞即转化为淋巴母细胞，再分化为致敏T淋巴细胞，参与细胞免疫，其免疫功能主要是抗胞内感染、瘤细胞与异体细胞等；而B淋巴细胞是先转化为浆母细胞
，再分化为浆细胞


，产生并分泌免疫球蛋白（抗体），参与体液免疫
，其功能是产生抗体，提呈抗原
，以及分泌细胞内因子参与免疫调节
；NK细胞不依赖抗原刺激而自发地发挥细胞毒效应，具有杀伤靶细胞的作用
。

方法简介
：

公司实验室分离的人外周血淋巴采用取外周血、通过密度梯度离心法制备而来
，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的人外周血淋巴经过检测
，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV
、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养信息：

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 悬浮

细胞形态 圆形

传代特性 不增殖
；不传代

消化液 0.25%

培养条件 气相
：空气
，95%；CO2
，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息
，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等

，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面

，显微镜下观察细胞状态。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片
，是正常现象
。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min
，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养
。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片

，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因

，个别敏感细胞会出现不稳定的情况

，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注

：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1
：2传代 。

9.注意
： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品
：

大鼠白细胞抗原DR(HLA-DR)检测试剂盒 ，英文名
： HLA-DR ELISA Kit

Lactamase inhibitors (BLI) ELISA Kit 小鼠β内酰胺酶抑制剂(BLI)检测试剂盒

ELISA 小鼠Foxp3(mouse Foxp3)  进口分装

CLIAKitforirGH(HumanImmunoreactivegrowthhormone)ELISAKit人免疫反应性生长激素

通用型(CO2)浓度酶偶联反应比色法定量检测试剂盒50次

ELISAKitTNF-α大鼠肿瘤坏死因子α

HA重组甲型流感 H7N9 (A/Shanghai/1/2013) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白 Protein

phospho-Smad2(p-Ser465 0.5mgphospho-Smad2(p-Ser465)petide 0酸化Smad2抗原

COCH重组人 Cochlin / COCH 蛋白 Protein

IL17RB Protein Human 重组人 IL17BR / IL17RB / IL-17 Receptor B 蛋白

CSF2 Protein Human 重组人 GM-CSF / CSF2 蛋白 (Fc 标签)

phospho-Smad2(p-Ser465 0.5mgphospho-Smad2(p-Ser465)petide 0酸化Smad2抗原

IL17RB Protein Human 重组人 IL17BR / IL17RB / IL-17 Receptor B 蛋白

HA重组甲型流感 H7N9 (A/Shanghai/1/2013) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白 Protein

CSF2 Protein Human 重组人 GM-CSF / CSF2 蛋白 (Fc 标签)

COCH重组人 Cochlin / COCH 蛋白 Protein

豚鼠免疫球蛋白G(IgG)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human cytotoxin (CTX) ELISA Kit 人细胞毒素(CTX)检测试剂盒

Humanai-cardiolipinaibodyIgG,ACA-IgGELISAKit 人抗心0脂抗体IgG(ACA-IgG)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

humanC-typelectindomainfamily4membere,CLEC4E检测试剂盒人C型凝集素结构域家族4成员E(CLEC4E)检测试剂盒规格
：96T/48T

组织EPHB2激酶活性定量检测试剂盒(A/B/C)20次

HumanProinsulin,PIELISAKit人胰岛素原(PI)检测试剂盒规格：96T/48T

人外周血淋巴细胞三0酸腺苷酶   英文名称：   Rat Adenosine iphosphate   规格：      英文缩写：   ATP

大鼠半胱天冬蛋白酶3   英文名称：   active cysteine-aspaic acid protease-3   规格：      英文缩写
：   Active Caspase-3

大鼠半胱天冬蛋白酶7   英文名称：   active cysteine-aspaic acid protease-7   规格
：      英文缩写：   Active Caspase-7

大鼠半胱天冬蛋白酶8   英文名称：   active cysteine-aspaic acid protease-8   规格
：      英文缩写：   Active Caspase-8