老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养：

1
、无菌条件下

，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小
；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s
，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置
，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min
，弃去上清
，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶
，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养
；

5
、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时
，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min
，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2
、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min
，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h
；

6

、用PBS冲洗3次
，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介
：

人乳腺癌血管内皮分离自患有乳腺癌的女性乳腺组织
；女性乳腺是由皮肤、纤维组织
、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌中99%发生在女性，男性仅占1%

。乳腺并不是维持机体生命活动的重要器官
，原位乳腺癌并不致命
；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身
，形成转移，危及生命
。目前，乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。

方法简介：

公司实验室分离的人乳腺癌血管内皮采用-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法
，并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的人乳腺癌血管内皮经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上
，且不含有HIV-1

、HBV、HCV
、支原体、细菌
、酵母和真菌等
。

培养信息
：

包被条件 PLL（0.1mg/ml）
，明胶（0.1%）

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 内皮细胞样

传代特性 可传2-3代

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%
；CO2，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基
、血清比例
、所需细胞因子等

，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面
，显微镜下观察细胞状态。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片
，是正常现象。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，
，用新鲜的*培养基重悬细胞

，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态
，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况
，请及时和老哥俱乐部联系
，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞
。收到细胞后次传代建议1
：2传代 。

9.注意
： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

大鼠生长调节致癌基因γ(GROγ)检测试剂盒 ，英文名： GROγ ELISA Kit

Mouse vitamin E (VE) ELISA Kit 小鼠(VE)检测试剂盒

RatHistamine,HISELISAKit 大鼠组胺(HIS)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforHDELISAKit大鼠组织蛋白去乙酰化酶

细胞VEGFR1(FLT-1)激酶活性定量检测试剂盒(A/B/C)20次

ELISAKitα-BGTα-银环蛇毒素

EPHA3重组小鼠 EphA3 蛋白 Protein

降钙素(CT)重组蛋白 Recombinant Calcitonin (CT)

CKM重组人 CKM / CK-MM 蛋白 Protein

CHST15 Protein Human 重组人 CHST15 / GALNAC4S-6ST / BRAG 蛋白

MET Protein Canine 重组狗 c-MET / HGFR 蛋白

降钙素(CT)重组蛋白 Recombinant Calcitonin (CT)

CHST15 Protein Human 重组人 CHST15 / GALNAC4S-6ST / BRAG 蛋白

EPHA3重组小鼠 EphA3 蛋白 Protein

MET Protein Canine 重组狗 c-MET / HGFR 蛋白

CKM重组人 CKM / CK-MM 蛋白 Protein

小鼠胎盘生长因子(PLGF)ELISA 试剂盒 96T/48T

Rat activin A (Activin-A) ELISA Kit 大鼠活化素A(Activin-A)检测试剂盒

Humangeneralanscriptioncomplex,GTCELISAKit 人通用转录复合体(GTC)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

Deererythrocytemembraneprotein,EMP检测试剂盒红细胞膜蛋白(EMP)检测试剂盒规格

：96T/48T

载玻片细胞脘蛋白(PRION)蛋白表达荧光显微镜检测试剂盒10/20次

MouseEndothelialniicoxidesyhase,eNOSELISAKit小鼠内皮型合成酶(eNOS)检测试剂盒规格：96T/48T

人乳腺癌血管内皮细胞小鼠酸性成纤维生长因子(mouse a-FGF)   作用：   ELISA   规格：      进口分装

小鼠碱性成纤维生长因子(mouse b-FGF/FGF-2)   作用：   ELISA   规格
：      进口分装

小鼠Fibronectin（mouse Fibronectin）   作用：   ELISA   规格
：      进口分装

小鼠Flt3(mouse Flt3)   作用：   ELISA   规格
：      进口分装