老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养
：

1
、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置
；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液
，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置
，重复此步骤2-3次，直至组织被消化
；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬
，接种于25cm2培养瓶
，放置于37℃ 
，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后
，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养

；二、免疫荧光鉴定

：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基

，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min
；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗
，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次
，每次10min
，按1
：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min

，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

人肺大动脉平滑肌分离自肺大动脉组织；肺大动脉亦称肺动脉干
。在呼吸空气的脊椎动物中
，把静脉血由心脏导向肺脏的动脉
。肺大动脉起于右心室，在主动脉之前向左上后方斜行，在主动脉弓下方分为左、右肺动脉
，经肺门入肺。肺动脉干位于心包内，为一粗短的动脉干
。起自右心室，在升主动脉前方向左后上方斜行

，至主动脉弓下方分为左、右肺动脉
。左肺动脉较短

，在左主支气管前方横行，分二支进入左肺上
、下叶
。右肺动脉较长而粗
，经升主动脉和上腔静脉后方向右横行，至右肺门处分为三支进入右肺上、中、下叶。肺大动脉平滑肌细胞是肺血管的重要结构细胞之一，在调控肺血管的收缩和舒张功能中有重要作用。肺大动脉平滑肌细胞原代分离培养3天后
，可见细胞贴壁伸展

，细胞形态大小不一
，呈梭形、不规则形、三角形或扇形
，核卵圆形


、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富
，有分枝状突起
，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏；细胞密度低时，常交织成网状；密度高时
，则排列为旋涡状或栅栏状
。传代后细胞生长较快，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点。肺大动脉平滑肌细胞的异常是肺动脉高压发生发展的重要病理学特征
，其凋亡和增殖失衡是肺血管重塑的关键。研究表明，急性和慢性缺氧均可导致肺动脉高压，即缺氧性肺动脉高压，推断缺氧可能是通过促进肺大动脉平滑肌细胞的增殖而参与缺氧性肺动脉高压的发生发展。肺大动脉平滑肌细胞主要功能
：①细胞表面表达介质（ICAM-1和VCAM-1）参与血管壁炎症反应
；②是多数重要动脉疾病的靶细胞。肺大动脉平滑肌细胞与主要病生理变化：①平滑肌增生易致肺动脉高压；②先天性肺动脉狭窄；③肺动脉栓塞。

方法简介：

公司实验室分离的人肺大动脉平滑肌采用-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的人肺大动脉平滑肌经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上
，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养信息：

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 成纤维细胞样

传代特性 可传5代左右
；3代以内状态佳

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气
，95%；CO2
，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液
、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面
，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h
。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min
，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞
。收到细胞后次传代建议1
：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

兔子高迁移率族蛋白1(HMG-1)ELISA 试剂盒

People androstene two ketone (ASD) ELISA Kit 人雄(ASD)检测试剂盒

Humanai-macrophageaibodyELISAKit 人抗巨噬细胞抗体(ai-macrophageAb)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

Humanepidemicparotitis,EP检测试剂盒人流行性腮腺(EP)检测试剂盒规格
：96T/48T

组织PKG激酶总活性定量检测试剂盒(A/B/C)20次

HumanPancreaticPolypeptide,PPELISAKit人胰多肽(PP)检测试剂盒规格
：96T/48T

FLT3重组小鼠 FLT-3 / CD135 / FLK-2 蛋白 Protein

红细胞生成素受体(EPOR)重组蛋白 Recombinant Erythropoietin Receptor (EPOR)

CRABP1重组人 CRABP1 / RBP5 蛋白 Protein

CDK5 Protein Human 重组人 CDK5 蛋白 (GST 标签)

IL17A Protein Canine 重组狗 IL17 / IL17A 蛋白

红细胞生成素受体(EPOR)重组蛋白 Recombinant Erythropoietin Receptor (EPOR)

CDK5 Protein Human 重组人 CDK5 蛋白 (GST 标签)

FLT3重组小鼠 FLT-3 / CD135 / FLK-2 蛋白 Protein

IL17A Protein Canine 重组狗 IL17 / IL17A 蛋白

CRABP1重组人 CRABP1 / RBP5 蛋白 Protein

小鼠K1(VK1)ELISA 试剂盒 96T/48T

Rat osteocalcin / bone gla protein (OT/BGP) ELISA Kit 大鼠骨钙素/骨谷蛋白(OT/BGP)检测试剂盒

HumanPeptidylprolylcis/ansisomerase,PPIELISAKit 人肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

ChickenIerleukin4,IL-4检测试剂盒鸡白介素4(IL-4)检测试剂盒规格
：96T/48T

载玻片细胞IKB-ALPHA蛋白表达荧光显微镜检测试剂盒10/20次

Mouseglucoprotein130,gp130ELISAKit小鼠糖蛋白130(gp130)检测试剂盒规格
：96T/48T

人肺大动脉平滑肌细胞小鼠细胞色素氧化酶（CC0）检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠(Cyt-C)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠细胞膜表面免疫球蛋白(SmIg)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠细胞间粘附分子3(ICAM-3/CD50)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装