老哥俱乐部

实验报告
：

一、分离与培养：

1

、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小
；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s
，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置

，重复此步骤2-3次
，直至组织被消化
；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min
，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶
，放置于37℃
，5％CO2 培养箱中培养；

5
、差速贴壁1h后
，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二

、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时
，弃去培养基
，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在4℃条件下

，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3
、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5
、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

人表皮成纤维分离自皮肤组织；表皮位于动物皮肤的外层，由胚胎时期外胚层形成，具有抗摩擦和抗损伤的作用。表皮是皮肤的浅层结构，由复层扁平上皮构成。从基底层到表面可分为五层，即基底层、棘层、颗粒层
、透明层和角质层

。成纤维细胞（Fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显
。成纤维细胞功能活动旺盛
，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化；成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用
。刚分离的表皮成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁

，其中部分开始伸出伪足
，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀，散在生长，不聚集成团；细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密


，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大
，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。细胞融合
，并彼此连接成网状；细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布
。

方法简介：

公司实验室分离的人表皮成纤维采用先消化、后-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法制备而来
，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的人表皮成纤维经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上
，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养信息

：

培养基 含FBS
、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 成纤维细胞样

传代特性 可传5代左右
；3代以内状态佳

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%
；CO2
，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好
，培养液是否有漏液

、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系
。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例
、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面
，显微镜下观察细胞状态
。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min
，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，
，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因
，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用
。

8. 备注
：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞
。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

人总胆汁酸(TBA)检测试剂盒

People of heterogeneous ribonucleoprotein complex (hNP/RA3 / ai RA33 aibody 人异质型核糖核蛋白复合物/抗RA33抗体(hNP/RA3

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Humanheparinsulphateprotoglycans,HSPG检测试剂盒人肝素糖蛋白(HSPG)检测试剂盒规格：96T/48T

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HumanmajorhistocompatibilitycomplexⅡ,MHCⅡ/HLA-ⅡELISAKit人主要组织相容性复合体Ⅱ类(MHCⅡ/HLA-Ⅱ)检测试剂盒规格
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KDM1A重组人 KDM1 / LSD1 蛋白 (His & GST 标签) Protein

CDH17 Protein Human 重组人 Cadherin-17 / LI-cadherin / CDH17 蛋白

TDGF1 Protein Rat 重组大鼠 Cripto / TDGF1 蛋白 (Fc 标签)

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小鼠细胞膜表面免疫球蛋白(SmIg)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human lymphocyte factor ELISA Kit 人淋巴细胞因子检测试剂盒

Humanα-enolaseELISAKit 人α烯醇化酶(α-enolase)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

Chickeninfectiouscoryza,ic检测试剂盒鸡传染性鼻抗体(IC)检测试剂盒规格
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载玻片细胞CYTOCHROMEC蛋白表达荧光显微镜检测试剂盒10/20次

MousegranzymesB,Gzms-BELISAKit小鼠颗粒酶B(Gzms-B)检测试剂盒规格：96T/48T

人表皮成纤维细胞小鼠心肽(ANP)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠过氧化物酶体增殖因子活化受体γ(PPAR-γ)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠毒性休克综合征毒素1(TSST-1)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠A(CsA)ELISAKit   ELISA.   96T/48T