實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

大鼠直腸黏膜上皮分離自直腸組織 ；直腸為大腸的未段 ，位於小骨盆內 。上端平第3骶椎處接續乙狀結腸 ，沿骶骨和尾骨的前麵下行 ，穿過盆膈 ，下端以門而終 。直腸上端的大小似結腸 ，其下端擴大成直腸壺腹 ，是糞便排出前的暫存部位 ，下端變細接管 。直腸在盆腔內的位置與骶椎腹麵關係密切 ，與骶椎有相同的曲度 。直腸周圍多脂肪、無縱帶 ，位於膀胱和生殖器官的背側 。直腸的動脈血供主要是來自腸係膜下動脈的直腸上動脈 ，來自髂內動脈的直腸中動脈和來自髂內動脈的直腸下動脈 。腸黏膜上皮細胞是機體內外環境的重要屏障 ，持續暴露於大量抗原中 ，也是機體麵對病原微生物的道防線 。因此 ，腸黏膜上皮細胞除有吸收 、分泌和轉運等重要生理功能之外 ，在黏膜先天性和獲得性免疫防禦機製中也起著重要作用 。腸黏膜上皮細胞作為先接觸抗原的細胞 ，在黏膜免疫反應的起始階段發揮關鍵作用 ，它決定黏膜免疫反應的發生 、性質和強度 。

方法簡介 ：

實驗室分離的大鼠直腸黏膜上皮采用先機械分離法 、後膠原酶消化法並通過上皮細胞專用培養基培養篩選製備而來 ，細胞總量約為5×10⁵cells/瓶 。

質量檢測

實驗室分離的大鼠直腸黏膜上皮經Cytokeratin-18免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

包被條件 ：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基 ：含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 ：每2-3天換液一次

生長特性 ：貼壁

細胞形態 ：上皮細胞樣

傳代特性 ：可傳1-2代

消化液 ：0.25%

培養條件 ：氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

大鼠直腸黏膜上皮體外培養周期有限 ；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養 ，以此保證該細胞的佳培養狀態 。

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

大鼠細胞間粘附分子5(ICAM5)檢測試劑盒  ，英文名 ： ICAM5 ELISA Kit

Mouse growth hormone releasing peptide ghrelin (GHRP-Ghrelin) ELISA Kit 小鼠生長激素釋放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin)檢測試劑盒

MouseTissuefactorpathwayinhibitor,TFPIELISAKit 小鼠組織因子途徑抑製物(TFPI)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforHsp-40(MouseHeatShockProtein40)ELISAKit小鼠熱休克蛋白40

細胞MAPKAPKINASE2激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20次

ELISAKitIL-18大鼠白介素18

EFNA5重組大鼠 Ephrin-A5 / EFNA5 蛋白 Protein

H5N1-M2(Avian influenza Matrix Protein-2 0.5mgH5N1-M2(Avian influenza Matrix Protein-2) H5N1流感病毒M2型(抗原)

SLAMF6重組人 SLAMF6 / Ly108 蛋白 Protein

FCER1A Protein Human 重組人 FcERI / FCER1A 蛋白

MAP2K1 Protein Mouse 重組小鼠 MEK1 / MAP2K1 / MKK1 蛋白 (His & GST 標簽)

H5N1-M2(Avian influenza Matrix Protein-2 0.5mgH5N1-M2(Avian influenza Matrix Protein-2) H5N1流感病毒M2型(抗原)

FCER1A Protein Human 重組人 FcERI / FCER1A 蛋白

EFNA5重組大鼠 Ephrin-A5 / EFNA5 蛋白 Protein

MAP2K1 Protein Mouse 重組小鼠 MEK1 / MAP2K1 / MKK1 蛋白 (His & GST 標簽)

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小鼠巰基轉移酶(GST)檢測試劑盒 96T/48T

Human retinol binding protein (RBP) ELISA Kit 人結合蛋白(RBP)檢測試劑盒

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