老哥俱乐部

实验报告
：

一
、分离与培养：

1
、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s

，置37℃条件下消化10min
，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s
，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5
、差速贴壁1h后
，吸出培养基
，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基
，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min
；

2、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在4℃条件下
，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次
，每次10min
，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min
；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗

，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次
，每次10min，按1
：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照

。

细胞简介：

眼动脉是眼眶及内容物主要的血液供应，是颈内动脉主要分枝，也是交通颅内外血管的重要通道。有研究结果认为
，绝大多数眼动脉起源于ICA刚出海绵窦处，且多数起源于ICA床突上段内上壁，少数起源于上壁，少数眼动脉可起源于ICA海绵窦段及脑膜中动脉。眼动脉的走行分为颅内段
、管内段及眶内段，眼动脉在管内段一般行走于视神经上方，颅内段和眶内段再分为五段：1
、短臂
；2、A角；3、长臂
；4、B角
；5、远侧部。眼动脉进入眶内后沿视神经向下外侧走行，终止于眶孔的上内侧角
。眼动脉的分枝一般分为眼组
、眶组及眶外组。眼组分为视网膜中央动脉睫前动脉及眼球的脉络丛；眶组分为泪腺动脉和肌动脉；眶外组分为筛后动脉
、筛前动脉、眶上动脉、睑内侧动脉、鼻背动脉(终末枝)
。眼动脉平滑肌细胞原代分离培养3天后，可见细胞贴壁伸展，细胞形态大小不一，呈梭形、不规则形
、三角形或扇形
，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形
，胞浆丰富，有分枝状突起，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏；细胞密度低时，常交织成网状；密度高时，则排列为旋涡状或栅栏状
。传代后细胞生长较快，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点。眼动脉供应整个眼球、眼球附属器及部分附近组织的营养
。眼动脉可发生痉挛、血栓
、栓塞及出血等，均可严重影响视力
。颈内动脉眼动脉瘤简称眼动脉瘤，又称床突旁动脉瘤或颈内动脉腹侧动脉瘤
。眼动脉瘤是位于眼动脉和后交通动脉之间的动脉瘤
，占全部颅内动脉瘤的0.47%～9.26%
，30%～70%患者表现为SAH，1/3有视功能损伤
，如视力减退、视野缺损和视神经等
。体外培养的眼动脉平滑肌细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义
。

方法简介：

实验室分离的大鼠眼动脉平滑肌采用-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

实验室分离的大鼠眼动脉平滑肌经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV
、HCV、支原体
、细菌
、酵母和真菌等。

培养信息：

包被条件
：

培养基：基础培养基，含FBS、EGF、bFGF
、Insulin

、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性
：贴壁

细胞形态：成纤维细胞样

传代特性
：可传3代左右

消化液
：0.25%

培养条件
：气相：空气，95%
；CO2，5%

大鼠眼动脉平滑肌体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的佳培养状态
。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好
，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息
，如细胞形态

、所用培养基、血清比例

、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致

，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片
，是正常现象

。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h
。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞
，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，
，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养
。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用
。

8. 备注

：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意
： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿

。

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