實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

大鼠心髒幹分離自心髒組織 ；心髒是脊椎動物身體中重要的一個器官 ，主要功能是為血液流動提供壓力 ，把血液運行至身體各個部分 。心髒由心肌構成 ，左心房 、左心室 、右心房 、右心室四個腔組成 。左右心房之間和左右心室之間均由間隔隔開 ，故互不相通 ，心房與心室之間有瓣膜（房室瓣） ，這些瓣膜使血液隻能由心房流入心室 ，而不能倒流 。心髒的作用是推動血液流動 ，向器官 、組織提供充足的血流量 ，以供應氧和各種營養物質 ，並帶走代謝的終產物（如二氧化碳 、無機鹽 、尿素和尿酸等） ，使細胞維持正常的代謝和功能 。研究發現 ，心髒幹細胞是一種多潛能細胞 ，具有再生和克隆能力 ，並可分化為心肌細胞 、平滑肌細胞和血管內皮細胞 。體內研究顯示 ，從心髒中分離出的心髒幹細胞 ，經體外簡單培養 、增殖和標記後 ，移植到心肌梗死邊緣區域 ，心梗血流動力學和心室壁厚度較對照組明顯改善 ，心肌梗死邊緣區域發現有標記的心肌細胞 、平滑肌細胞和內皮細胞 。盡管其新生心肌細胞較小 ，但表達一些特殊肌蛋白如心髒肌球蛋白重鏈 、α-肌動蛋白 、α-輔肌動蛋白 、連接蛋白等 ，證實了心髒幹細胞對心肌梗死的修複作用 。幹細胞移植治療是目前心肌梗死和缺血性心髒病細胞重建的主要方法 ，成體幹細胞中的c-kit陽性心髒幹細胞因其來源於心髒 ，有定向心髒細胞係分化的趨勢 ，體內外可以分化成心肌細胞 、血管內皮細胞和平滑肌細胞 ，同時自體移植不存在免疫排斥反應及倫理問題已經成為目前研究的熱點 。短期內獲得治療量的自體心髒幹細胞是這一治療應用於臨床的關鍵所在 。因此 ，研究一種新的分離培養方法可在短時期內獲得大量純度較高的自體c-kit陽性心髒幹細胞成為目前幹細胞領域研究的熱點問題之一 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的大鼠心髒幹采用機械剪碎組織 、膠原酶分次消化法結合差速貼壁 、心髒幹細胞專用培養基培養篩選製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的大鼠心髒幹經c-kit免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

包被條件 PLL（0.1mg/ml）

培養基 含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 長梭形

傳代特性 可傳3代左右

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

大鼠線粒體解偶聯蛋白1(UCP1)檢測試劑盒  ，英文名 ： UCP1 ELISA Kit

Pla vitamin E (VE) ELISA Kit 植物(VE)檢測試劑盒

MouseImmunoglobulinE,IgEELISAKit 小鼠免疫球蛋白E(IgE)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforHumanalpha-granularmembraneprotein,GMP-140ELISAKit人血漿α顆粒膜蛋白

細胞HHV6(HUMANHERPESVIRUS6)病毒定性檢測試劑盒20次

ELISAKitSOD大鼠超氧化物歧化酶

PDCD1重組人 PD1 / PDCD1 蛋白 Protein

尾加壓素2(UST2)重組蛋白 Recombinant Urotensin 2 (UST2)

RAET1E重組人 RAET1E / ULBP4 蛋白 (Fc 標簽) Protein

CD55 Protein Human 重組人 CD55 / DAF 蛋白

HA Protein H1N3 重組甲型流感 H1N3 (A/duck/NZL/160/1976) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白

尾加壓素2(UST2)重組蛋白 Recombinant Urotensin 2 (UST2)

CD55 Protein Human 重組人 CD55 / DAF 蛋白

PDCD1重組人 PD1 / PDCD1 蛋白 Protein

HA Protein H1N3 重組甲型流感 H1N3 (A/duck/NZL/160/1976) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白

RAET1E重組人 RAET1E / ULBP4 蛋白 (Fc 標簽) Protein

小鼠血管緊張素轉換酶(ACE)檢測試劑盒 96T/48T

Rat calcium binding protein (CR) ELISA Kit 大鼠鈣結合蛋白(CR)檢測試劑盒

Humanai-myelinaibodyIgAELISAKit 人抗髓0脂抗體IgA(ai-myelinAb)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CamelBeta-Endorphin,β-EP檢測試劑盒β內啡肽(β-EP)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

魚類組織元素熒光定量檢測試劑盒20次

Mouseinsulinaoaibodies,IAAELISAKit小鼠胰島素自身抗體(IAA)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

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