實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

大鼠退行性椎間盤髓核分離退行性椎間盤組織 ；椎間盤是位於脊柱兩椎體之間 ，分為中央部的髓核 ，富於彈性的膠狀物質 ；周圍部的纖維環 ，由多層纖維軟骨環按同心圓排列 。上下有軟骨板 ，是透明軟骨複蓋於椎體上 ，下麵骺環中間的骨麵 。上下的軟骨板與纖維環一起將髓核密封起來 。纖維環由膠原纖維束的纖維軟骨構成 ，位於髓核的四周 。纖維環的纖維束相互斜行交叉重疊，使纖維環成為堅實的組織 ，能承受較大的彎曲和扭轉負荷 。髓核 ，是乳白色半透明膠狀體 ，富於彈性 ，為椎間盤結構的一部分 ，位於兩軟骨板與纖維環之間 。由縱橫交錯的纖維網狀結構即軟骨細胞和蛋白多糖黏液樣基質構成的彈性膠凍物質 。嬰幼兒時期的髓核含水量為80%-90% ，即使到了老年 ，其含水量也在70%上下 。髓核在出生時體積大而鬆散 ，位於椎間盤的中央 ，至成年時位置移至椎間盤的中後部 ；在成年以前構成髓核的主要物質是大量蛋白多糖複合體 、膠原纖維和纖維軟骨 ，隨著年齡的增長 ，髓核中的蛋白多糖解聚增多 ，水分逐漸減少 ，膠原增粗並逐漸被纖維軟骨所替代 。

方法簡介 ：

實驗室分離的大鼠退行性椎間盤髓核采用膠原酶-混合消化法並結合軟骨細胞專用培養基培養篩選製備而來 ，細胞總量約為5×10⁵cells/瓶 。

質量檢測

實驗室分離的大鼠退行性椎間盤髓核經Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

培養基 ：基礎培養基 ，含FBS 、EGF 、Transferrin 、Selenium Solution 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 ：每3-4天換液一次

生長特性 ：貼壁

細胞形態 ：梭形 、多角形

傳代特性 ：可傳3代左右

消化液 ：0.25%

培養條件 ：氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

大鼠退行性椎間盤髓核體外培養周期有限 ；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養 ，以此保證該細胞的佳培養狀態 。

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

大鼠氧化酶(DAO)檢測試劑盒  ，英文名 ： DAO ELISA Kit

Porcine coisol (Coisol) ELISA Kit 豬(Coisol)檢測試劑盒

特定基因序列(Deer)核酸檢測試劑盒 48T

CLIAKitforM2-PK(HumanPyruvateKinase)ELISAKit人同酸激酶M2型同工酶

體液總膽汁酸酶連續循環比色法定量檢測試劑盒20次

ELISAKitACAC雞乙酰乙酸檢測

LIFR重組人 LIFR / CD118 蛋白 Protein

血紅蛋白μ(HBμ)重組蛋白 Recombinant Hemoglobin Mu (HBm)

HA重組甲型流感 H5N1 (A/turkey/Turkey/1/2005) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 蛋白 Protein

CD3D Protein Human 重組人 CD3d / CD3 delta 蛋白

GP140 Protein HIV 重組人類免疫缺陷病毒Ⅰ型 HIV-1 gp140 蛋白 (group M, subtype CRF07_BC) (Fc 標簽)

血紅蛋白μ(HBμ)重組蛋白 Recombinant Hemoglobin Mu (HBm)

CD3D Protein Human 重組人 CD3d / CD3 delta 蛋白

LIFR重組人 LIFR / CD118 蛋白 Protein

GP140 Protein HIV 重組人類免疫缺陷病毒Ⅰ型 HIV-1 gp140 蛋白 (group M, subtype CRF07_BC) (Fc 標簽)

HA重組甲型流感 H5N1 (A/turkey/Turkey/1/2005) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 蛋白 Protein

小鼠血紅素氧合酶2(HO-2)ELISA 試劑盒 96T/48T

Rat catecholamine (CA) ELISA Kit 大鼠兒茶酚胺(CA)檢測試劑盒

Humanβ-glucosidaseELISAKit 人β葡糖苷酶(β-glucosidase)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitfor乙型肝二對半全套

營養補充劑L-天化學比色法定量檢測試劑盒20次

MouseIerleukin11,IL-11ELISAKit小鼠白介素11(IL-11)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

大鼠退行性椎間盤髓核細胞小鼠乙型肝e抗體(HBeAb)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠乙型肝e抗原(HBeAg)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠乙型肝表麵抗體(HBsAb)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠氧化酶(DAO)ELISAKit   ELISA.   96T/48T