老哥俱乐部

实验报告：

一
、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小
；

2

、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min
，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s

，置37℃消化10 min后
，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液

，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ 
，5％CO2 培养箱中培养；

5
、差速贴壁1h后
，吸出培养基
，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二

、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2
、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下

，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min
；

4

、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5
、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介
：

大鼠气管成纤维分离自气管组织；气管（Trachea）
，呼吸器官的一部分；为后壁略平的圆筒型管状
。上端平第六颈椎下缘
，与环状软骨相连
；向下至第四
、五胸椎体（相当胸骨角平面）交界处

，分左、右主支气管，分叉处称为气管杈
。气管主要由14-16个半环状软骨构成
，有弹性
，软骨为“C"字形的软骨环，缺口向后，各软骨环以韧带连接起来
，环后方缺口处由平滑肌和致密结缔组织连接，保持了持续张开状态。管腔衬以粘膜，表面覆盖纤毛上皮
，粘膜分泌的粘液可粘附吸入空气中的灰尘颗粒
，纤毛不断向咽部摆动将粘液与灰尘排出，以净化吸入的气体。成纤维细胞（Fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大
，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形
，核仁大而明显
。成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化
；成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用。刚分离的支气管成纤维细胞呈圆形
、折光性良好，悬浮于培养基中
。30min细胞贴壁
，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁
，伸展成梭形

，胞核清晰
，分布较均匀，散在生长，不聚集成团
；细胞生长迅速
，5-7天即呈融合状态
，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长
，平坦
、胞体较大
，细胞质透明
，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。细胞融合
，并彼此连接成网状；细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布
。气管成纤维细胞在生理条件下的主要功能包括
：构造和维持组织的正常形态，合成和释放细胞外基质以及组织损伤后及时大量聚集修复损伤组织
。

方法简介：

实验室分离的大鼠气管成纤维采用胶原酶-联合消化法结合差速贴壁法制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

实验室分离的大鼠气管成纤维经Vimentin免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上

，且不含有HIV-1
、HBV、HCV
、支原体、细菌、酵母和真菌等
。

培养信息
：

培养基：含FBS
、生长添加剂、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：成纤维细胞样

传代特性
：可传3代左右

消化液：0.25%

培养条件：气相：空气，95%
；CO2，5%

大鼠气管成纤维体外培养周期有限
；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的培养状态。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好

，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息
，如细胞形态
、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等
，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h
。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞

，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，，用新鲜的*培养基重悬细胞
，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因

，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意
： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品
：

大鼠泛素蛋白(Ub)检测试剂盒 ，英文名： Ub ELISA Kit

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