實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

大鼠角膜基質分離自眼角膜組織；角膜位於眼球前壁的一層透明膜 ，約占纖維膜的前1/6 ，從後麵看角膜呈正圓形 ，從前麵看為橫橢圓形 。角膜厚度各部分不盡相同 ，中央部薄 。角膜有十分敏感的神經末梢 ，如有外物接觸角膜 ，眼瞼便會不由自主地合上以保護眼睛 。為了保持透明 ，角膜並沒有血管 ，透過外界空氣 、淚液及房水獲取養份及氧氣 。角膜分為五層 ，由前向後依次為 ：上皮細胞層 、前彈力層、基質層 、後彈力層 、內皮細胞層 。角膜基質層是角膜的主要組成部分 ，占據角膜厚度的90% ，由角膜基質細胞 、膠原纖維和細胞外基質構成 。角膜基質層缺損的修複主要由角膜基質細胞的增殖及分泌細胞外基質完成 。角膜基質層具有結構規整 ，透明度高的特點 ，正常情況下角膜基質細胞分泌組成基質層的成分 ，維持角膜的透明度 ，此細胞對於角膜損傷的修複具有重要意義 。角膜基質細胞 ，存在於角膜基質層中 ，在正常情況下 ，處於靜止狀態 。但當角膜損傷時 ，不同上皮來源的因子及環境信號 ，將影響角膜基質細胞的應答反應 ，決定著角膜能否被修複 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的大鼠角膜基質采用膠原酶消化後組織貼塊法製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的大鼠角膜基質經Vimentin免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

培養基 含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 梭形 、多角形

傳代特性 可傳2-3代

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代 。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

直鏈澱粉   250mg

Amylose,fromPotato   1g

抗蛋白酶   250mg

Aipain,Dihydrochloride   1g

植物D(VD)ELISA 試劑盒

Human ai Golgi aibody (AGAA) ELISA Kit 人抗高爾基體抗體(AGAA)試劑盒

PorcineLeptin,LEPELISAKit 豬瘦素(LEP)試劑盒 進口分裝

CLIAKitforAFP(HumanAlpha-fetoprotein)ELISAKit人甲種胎兒球蛋白/甲胎蛋白

血液血管緊張素Ⅰ轉化酶(ACE)總活性比色法定量試劑盒20次

Mousethrombieceptor,ELISAKit小鼠受體()試劑盒

REN重組小鼠 REN1 / Renin-1 蛋白 (His 標簽) Protein

CD14(cluster of differentiation antigen 14 0.5mgCD14(cluster of differentiation antigen 14) CD14/內毒素受體抗原

NAMPT重組人 PBEF / Visfatin / NAMPT 蛋白 (His & GST 標簽) Protein

ACYP2 Protein Human 重組人 ACYP2 / Acylphosphatase-2 蛋白 (GST 標簽)

SERPINE1 Protein Rat 重組大鼠 SerpinE1 / PAI-1 蛋白 (His 標簽)

CD14(cluster of differentiation antigen 14 0.5mgCD14(cluster of differentiation antigen 14) CD14/內毒素受體抗原

ACYP2 Protein Human 重組人 ACYP2 / Acylphosphatase-2 蛋白 (GST 標簽)

REN重組小鼠 REN1 / Renin-1 蛋白 (His 標簽) Protein

SERPINE1 Protein Rat 重組大鼠 SerpinE1 / PAI-1 蛋白 (His 標簽)

NAMPT重組人 PBEF / Visfatin / NAMPT 蛋白 (His & GST 標簽) Protein

大鼠角膜基質細胞小鼠α甘露糖苷酶(α Manase)ELISA 試劑盒

Rat aquaporin 0 (AQP-0) ELISA Kit 大鼠水通道蛋白0(AQP-0)試劑盒

HumanPlacealalkalinepkosphatase,PLAPELISAKit 人胎盤堿性0酸酶(PLAP)試劑盒 進口分裝

Humanchondroitinsulfate,CS試劑盒人軟骨素(CS)試劑盒

總乳酸待測樣品處理試劑盒20次

HumanSc1-70Aibody,Sc1-70-AbELISAKit人抗Sc1-70抗體(Sc1-70-Ab)試劑盒