老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液

，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化


；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬
，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5
、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养
；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基
，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次

，每次10min
，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3

、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min

；

4
、按1: 100的比例稀释α-actin一抗
，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min
，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h；

6
、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介
：

大鼠关节囊成纤维分离自关节囊组织；关节囊（articular capsule）是由结缔组织构成的膜囊
，附着于关节的周围，密封关节腔。关节囊的壁共有两层：外层为纤维层；内层为滑膜层

。纤维层实际上是一个连结骨的骨膜向另一骨骨膜的移行。纤维层厚而坚韧，由致密结缔组织构成，含有丰富的血管和神经
。其浅层纤维多呈纵行排列；深层纤维主要为环行纤维。纤维层的厚薄
，各个关节不相同，即是在同一关节中
，各部也不一致一般在运动范围小的或是负重较大的关节中，都较厚而紧张，相反，于运动灵活的关节
，则较薄而松弛
。有的关节囊的部分纤维囊缺如，仅一层滑膜层
；有的部分明显增厚，形成韧带。滑膜层薄而柔润
，是由疏松结缔组织构成，衬在纤维层内面，周缘附着在关节软骨的边缘。它朝向关节腔的内面光而发亮，此面上盖有一层内皮细胞。滑膜向关节腔分泌滑液，滑液是稍粘稠而透明的液体
，可减少关节中相连骨的摩擦，是一种滑润剂。滑膜表面可形成绒毛或皱襞突入关节腔内。有时滑膜层可以穿过纤维层呈囊状向外膨出，形成滑膜囊，常位于肌腱与骨面之间
。有时滑膜层突出不明显
，仅呈深窝状

，称为囊状隐窝。成纤维细胞（Fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分
，由胚胎时期的间充质细胞分化而来
；成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构
，其细胞核呈规则的卵圆形
，核仁大而明显。成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化；成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用。刚分离的成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁，伸展成梭形
，胞核清晰，分布较均匀
，散在生长
，不聚集成团；细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。细胞融合，并彼此连接成网状
；细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。

方法简介

：

实验室分离的大鼠关节囊成纤维采用混合酶消化结合差速贴壁法制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

实验室分离的大鼠关节囊成纤维经Vimentin免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上
，且不含有HIV-1、HBV
、HCV
、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养信息：

培养基：基础培养基，含FBS、bFGF、Insulin、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性
：贴壁

细胞形态：成纤维细胞样

传代特性：可传3代左右

消化液：0.25%

培养条件
：气相
：空气，95%；CO2
，5%

大鼠关节囊成纤维体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养
，以此保证该细胞的培养状态。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好
，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书
，了解细胞相关信息，如细胞形态
、所用培养基、血清比例
、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态
。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片
，是正常现象。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min
，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞
，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用
。

8. 备注
：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

大鼠肥大细胞类(MCT)检测试剂盒 ，英文名
： MCT ELISA Kit

Porcine soluble vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2/sFLK-1 猪可溶性血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2/sFLK-1

牛特定基因序列(Bovine)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 48T

CLIAKitformALBELISAKit大鼠微量蛋白

体液(NO)活性比色法定量检测试剂盒50次

ELISAKiteNOS内皮型合成酶

MOG重组小鼠 MOG (aa30-149) 蛋白 Protein

白介素18(IL18)重组蛋白 Recombinant Interleukin 18 (IL18)

ENO3重组人 ENO3 / beta-enolase 蛋白 Protein

CCL17 Protein Human 重组人 CCL17 / TARC / SCYA17 蛋白

CD160 Protein Cynomolgus 重组食蟹猴 CD160 蛋白

白介素18(IL18)重组蛋白 Recombinant Interleukin 18 (IL18)

CCL17 Protein Human 重组人 CCL17 / TARC / SCYA17 蛋白

MOG重组小鼠 MOG (aa30-149) 蛋白 Protein

CD160 Protein Cynomolgus 重组食蟹猴 CD160 蛋白

ENO3重组人 ENO3 / beta-enolase 蛋白 Protein

小鼠正常T细胞表达和分泌因子(RAES/CCL5)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human proliferating cell nuclear aigen aibody (PCNA) ELISA Kit 人抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)检测试剂盒

Humanai-ophoblastaibody,ATAELISAKit 人抗滋养膜细胞抗体(ATA)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforABeta1-42(Mouseamyloidbetapeptide1-42)ELISAKit小鼠β淀粉样蛋白1-42

乙醇待测样品处理试剂盒20次

MouseNeonatalThyroxine,NN-T4ELISAKit小鼠新生甲状腺素(NN-T4)检测试剂盒规格：96T/48T

大鼠关节囊成纤维细胞血清淀粉样蛋白   英文名称
：   serum amyloid A protein   规格：      英文缩写


：   SAA

Salusin-α   英文名称：   Salusin-α   规格：      英文缩写：   Salusin-α

干细胞因子   英文名称
：   stem cell factor   规格：      英文缩写
：   SCF

干细胞因子受体   英文名称：   stem cell factor receptor   规格：      英文缩写
：   SCF R