實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

大鼠肝內膽管上皮分離自肝髒組織 ；肝髒是身體內以代謝功能為主的一個器官 ，並在身體裏麵起著去氧化 、儲存肝糖 、分泌性蛋白質的合成等作用 ；肝髒也製造消化係統中之膽汁 。肝髒是機體內髒裏大的器官 ，位於機體中的腹部位置 ，在右側橫隔膜之下 ，位於膽囊之前端且於右邊腎髒的前方，胃的上方 。肝髒是機體消化係統中大的消化腺 ，為一紅棕色的V字形器官。肝髒是尿素合成的主要器官 ，又是新陳代謝的重要器官 。肝髒在機體位置和形態結構 ：肝髒位於右上腹 ，隱藏在右側膈下和肋骨深麵 ，大部分肝為肋弓所複蓋 ，僅在腹上區 、右肋弓間露出並直接接觸腹前壁 ，肝上麵則與膈及腹前壁相接 。通過控製激素調控的分泌和吸收 ，在保持 、調整和擴大膽小管的結構中發揮重要作用 ，肝內膽管上皮細胞在先天性和獲得性免疫應答方麵起著積極作用 。肝內膽管上皮細胞約占肝細胞總數的5% ，其在肝內膽道係統內形成複雜的網狀管形結構 。肝內膽管上皮細胞具有複雜的生理代謝功能 ，參與肝髒的代謝 、排泌 、免疫等生理過程 ，在肝髒疾病的發生發展過程中起一定的作用 。研究表明，常見的肝內膽管病變例如原發性硬化性膽管炎 、膽管癌等疾病 ，都是以肝內膽管上皮細胞為病變靶位 ，進而引起肝內膽管上皮損傷 。因此 ，了解正常肝內膽管上皮細胞的生物學特征和病變肝內膽管上皮細胞的病理特征對研究肝內膽管病變的發病機製 、診斷和治療具有重要意義 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的大鼠肝內膽管上皮采用膠原酶灌注消化法後 ，再用膠原酶-DNA酶聯合消化 ，接種至預先包被鼠尾膠原的培養瓶中 ，通過上皮細胞專用培養基培養篩選製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的大鼠肝內膽管上皮經Cytokeratin-19免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

包被條件 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基 含FBS、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 上皮細胞樣

傳代特性 可傳1-2代

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

豬α葡萄糖苷酶（α-Glu）試劑盒     試劑盒   組裝/原裝

豬α幹擾素(IFN-α)試劑盒     試劑盒   組裝/原裝

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豬膽囊收縮素/腸促肽(CCK)ELISA 試劑盒

Human macrophage colony stimulating factor (M-CSF) ELISA Kit 人巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)試劑盒

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血液0酸二酯酶1(PDE1)活性酶連續循環光譜法定量試劑盒10次

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HA重組甲型流感 H10N3 (A/duck/Hong Kong/786/1979) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 蛋白 (His 標簽) Protein

SDF-1/CXCL12 基質細胞衍生因子1 0.5mgSDF-1/CXCL12 基質細胞衍生因子1

CA10重組人 Carbonic Anhydrase X / CA10 蛋白 (His 標簽) Protein

AMBP Protein Human 重組人 AMBP / Alpha 1 microglobulin 蛋白 (His 標簽)

IL1RAPL2 Protein Human 重組人 IL-1R9 / IL1RAPL2 蛋白

SDF-1/CXCL12 基質細胞衍生因子1 0.5mgSDF-1/CXCL12 基質細胞衍生因子1

AMBP Protein Human 重組人 AMBP / Alpha 1 microglobulin 蛋白 (His 標簽)

HA重組甲型流感 H10N3 (A/duck/Hong Kong/786/1979) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 蛋白 (His 標簽) Protein

IL1RAPL2 Protein Human 重組人 IL-1R9 / IL1RAPL2 蛋白

CA10重組人 Carbonic Anhydrase X / CA10 蛋白 (His 標簽) Protein

大鼠肝內膽管上皮細胞小鼠酶2(CA-2)ELISA 試劑盒

Rat activated protein C (APC) ELISA Kit 大鼠活化蛋白C(APC)試劑盒

HumanCytochromeP450c21/21-hydroxylase,CYP21BELISAKit 人細胞色素P450c21B/21-羥化酶(CYP21B)試劑盒 進口分裝

Cobravenomfactor,CVF試劑盒毒蛇因子(CVF)試劑盒

載玻片細胞鈣ATP酶SERCA蛋白表達熒光顯微鏡試劑盒10/20次

Mouseendotoxin,ETELISAKit小鼠內毒素(ET)試劑盒