實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

大鼠肺小動脈內皮分離自肺小動脈組織 ；肺動脈幹是短而粗的動脈 ，自右心室的動脈圓錐起始 ，向左後上方斜升，先在升主動脈根部的前麵，繼而至其左側 ，至主動脈弓的下方 ，約在第5胸椎高度 ，分為左 、右肺動脈 。左肺動脈較短 ，橫行向左 ，經左主支氣管前方至左肺門 ，分兩支進入左肺的上 、下葉 。右肺動脈較長 ，橫行向右 ，經主動脈升部和上腔靜脈的後方達右肺門 ，分3支進入右肺上 、中 、下葉 。左 、右肺動脈的各分支在肺實質內又反複分支 ，與支氣管的分支伴行 ，最後達肺泡壁 ，形成稠密的毛細血管網 。肺動脈輸送的是含二氧化碳較多的靜脈血 。在肺動脈幹分叉處稍左側與主動脈弓下緣之間有一結締組織索，稱動脈韌帶 。管徑在0.3～1mm之間 ，為小動脈（small-artery） ，小動脈包括粗細不等的幾級分支 ，也屬肌性動脈 。較大的小動脈 ，內膜有明顯的內彈性膜 ，中膜有幾層平滑肌 ，外膜厚度與中膜相近 ，一般沒有外彈性膜 。口徑在1mm以下的動脈 ，管壁有完整的平滑肌層及少量的彈性纖維和膠質纖維 。小動脈是決定周圍循環阻力大小的主要因素 ，也是調節微循環灌注量的“總開關" 。典型的小動脈 ，其管壁的厚度與管徑相比約為1∶2 。中膜的肌層相對比其他動脈為厚 ，當平滑肌在神經支配下強力收縮時 ，其管腔可以閉塞 ，而使血液不能流入它所分布的毛細血管內 ，從而增加了周圍血液循環的阻力 。如果有許多小動脈同時收縮 ，可使血壓顯著上升 。反之 ，當小動脈的平滑肌舒張時 ，則可使大量的血液流入毛細血管 ，外周阻力明顯下降 ，血壓降低 。終末小動脈(terminal arteri-ole)的口徑為20～30μm ；後小動脈(metar-teriole) ，又稱毛細血管前小動脈(precapil-lary arteriole)的口徑為12～15μm 。管壁內均有較稀疏的平滑肌 ，在毛細血管前小動脈分支的起始部分 ，管壁平滑肌成分增厚 ，叫做毛細血管前括約肌(precapillary sphinc-ter) ，其收縮或舒張 ，可調節真毛細血管的血流量 ，是調節微循環灌注量的“分開關"。支配小動脈平滑肌的交感神經纖維 ，可延伸到終末小動脈和後小動脈的平滑肌細胞 。在毛細血管前括約肌上交感神經纖維特別豐富 。肺小動脈內皮細胞呈單層多角形鋪路石狀分布 ，該細胞在維持血管內外的動態平衡 、合成和分泌細胞因子和介質 、維持凝血和纖溶的動態平衡中起重要作用 。

方法簡介 ：

實驗室分離的大鼠肺小動脈內皮采用-膠原酶聯合消化法結合差速貼壁法 、並通過內皮細胞專用培養基培養篩選製備而來 ，細胞總量約為5×10⁵cells/瓶 。

質量檢測

實驗室分離的大鼠肺小動脈內皮經CD31免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等。

培養信息 ：

包被條件 ：PLL（0.1mg/ml） ，明膠（0.1%）

培養基 ：基礎培養基 ，含FBS 、EGF 、bFGF 、IGF 、VEGF 、Heparin 、Hydrocortisone 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 ：每2-3天換液一次

生長特性 ：貼壁

細胞形態 ：內皮細胞樣

傳代特性 ：可傳2-3代

消化液 ：0.25%

培養條件 ：氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

大鼠肺小動脈內皮體外培養周期有限 ；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養 ，以此保證該細胞的培養狀態 。

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ，，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

大鼠過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)檢測試劑盒  ，英文名 ： PPAR-α ELISA Kit

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TGFB1重組狗 TGF-beta 1 / TGFB1 蛋白 Protein

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