老哥俱乐部

使用方法:
一
、样品 DNA 的制备
用自选方法提取 Cps DNA。注意：DNA 纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素
。如果不能很好纯化样品 DNA
，后面的 PCR 再灵敏也不能提高整体检测灵敏度
。
二、制备 Cps 标准曲线（以 10-10E6 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的

、可以直接使用的 DN**段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管
，分别为 6
，5

，4，3，2 和 1 号。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（用带芯枪头，下同）
。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用 TE 缓冲液或超纯水 10 倍梯度稀释到10E7 拷贝/μL（注
：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10E7拷贝/μL
，建议每次稀释 10 倍
，梯度稀释至 10E7 拷贝/μL）。
4. 在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的 Cps 阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟
，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。
5. 换枪头，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中
，充分震荡 1 分钟
，得 10E5拷贝/μL 的阳性对照。
6. 换枪头，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中
，重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照
。
7. NC 管中不加任何阳性对照。
8. 从 1-6 号管中分别取 5 μL 和待测样品一起进行定量 PCR（见下步）
，每个样品做 3 次重复。PCR 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 PCR Ct 值
，并以之为纵轴

，以浓度的对数值为横轴
，绘制标准曲线。

参数规格
：

储存条件
：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清
：使用不含热原和内毒素的试管
，操作过程中避免任何细胞刺激

，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离
。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清
。
3. 细胞上清液
：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物
。
4. 组织匀浆
：将组织加入适量生理盐水捣碎
。3000 转离心10 分钟取上清
。
5. 保存
：如果样本收集后不及时检测
，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
​
检测步骤
：
一

、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)
、酶混合物(Enzymes MIX)
，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s
。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表
：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量

，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s
，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒
。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团
：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

4-己-4`-[2-(4-异硫)乙]-1,1`-联：399.594- -4`-[2- (4- hexyl isothiocyanate phenyl) ethyl biphenyl]-1,1`-

：110499-97-3 C27H29NS

1-(2-溴乙氧)-2,4-二氯：269.951- (2-) -2,4- two：6954-77-4 C8H7BrCl2O

1-溴代萘
：207.071- bromide：33186 C10H7Br

2-溴代萘：207.072- bromide：580-13-2 C10H7Br

2-(3-噻吩)乙
：156.212- (3-) ethanol hydrazine：175276-94-5 C6H8N2OS

AB双液TMB显色液B TMB double liquid A color solution：：

2-辛并咪唑：230.352- octyl benzimidazole
：13060-24-7 C15H22N2

荧光素醋Fluorescein acetic acid：593.7 C23H35N9O4S · C2H4：96087-38-6

腈菌唑
：288.78腈菌唑：88671-89-0 C15H17ClN4

鸟分枝杆菌类结核亚型LAMP试剂盒小鼠 ERBB2 基因全长ORF克隆

小鼠 PDPK1 基因全长ORF克隆

人 Fetuin-A / AHSG / FETUA ELISA配对抗体

雪貂 IFNG 基因全长ORF克隆

人 EIF4H 基因全长ORF克隆

人 LGALS9 转录变体2 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签

人 ILT6 / LILRA3 人细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

人 PFN2 基因全长ORF克隆

小鼠 TUBB2A 基因全长ORF克隆

人 FCAR / CD89 人细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

人 HSP70 / HSPA1A 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

人 CASP14 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签