可用作測定的標本十分廣泛
，體液(如血清)
、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液
、糞便)等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份
。有些標本可直接進行測定(如血清、尿液)
，有些則需經預處理(如糞便和某些分泌物)
。大部分ELISA檢測均以血清為標本
。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外
，其他成份均同等於血清
。製備血漿標本需借助於抗凝劑
，而血清標本隻要待血清自然凝固
、收縮後即可取得
。除特殊情況外
，在醫學檢驗中均以血清作為檢測標本
。在ELISA中血漿和血清可同等應用
。
血清標本可按常規方法采集
，應注意避免溶血
，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質
，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色
。血清標本宜在新鮮時檢測
。如有細菌汙染
，菌體中可能含有內源性HRP
，也會產生假陽性反應。如在冰箱中保存過久，其中的可發生聚合
，在間接法ELISA中可使本底加深
。一般說來
，在5天內測定的血清標本可放置於4℃
，超過一周測定的需低溫冰存
。凍結血清融解後
，蛋白質局部濃縮
，分布不均
，應充分混勻宜輕緩
，避免氣泡
，可上下顛倒混和
，不要在混勻器上強烈振蕩
。混濁或有沉澱的血清標本應先離心或過濾
，澄清後再檢測
。反複凍融會使抗體效價跌落
，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測
，宜少量分裝冰存
。保存血清自采集時就應注意無菌操作
，也可加入適當防腐劑(見3.2.4)
。
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑
。ELISA中用的蒸餾水或去離子水
，包括用於洗滌的
，應為新鮮的和高質量的
。自配的緩衝液應用pH計測量較正
。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡後使用
。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存
。
在ELISA試劑盒檢測中一般有3次加樣步聚
，即加標本
，加酶結合物
，加底物
。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部
，避免加在孔壁上部
，並注意不可濺出
，不可產生氣泡
。加標本一般用微量加樣器
，按規定的量加入板孔中
。每次加標本應更換吸嘴
，以發生交叉汙染
，也可用一次性的定量塑料管加樣
。有此測定(如間接法ELISA)需用稀的血清
，可在試管中按規定的稀釋度稀釋後再加樣
。也可在板孔中加入稀釋液
，再在其加入血清標本
，然後在微型震蕩器上震蕩1分鍾以保證混和
。加酶結合物應用液和底物用液時可用定量多道加液器
，使加液過程迅速完成
。