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索氏梭狀芽孢杆菌PCR檢測試劑盒反應五要素
點擊次數 :866 更新時間 :2019-11-13

反應五要素 :
參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶 、dNTP 、模板和Mg2+
引物 :引物是PCR特異性反應的關鍵 ,PCR 產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度 。理論上 ,隻要知道任何一段模板DNA序列 , 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物 ,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增 。設計引物應遵循以下原則 :
①引物長度 : 15-30bp ,常用為20bp左右 。
②引物擴增跨度 : 以200-500bp為宜 ,特定條件下可擴增長至10kb的片段 。
③引物堿基 :G+C含量以40-60%為宜 ,G+C太少擴增效果不佳 ,G+C過多易出現非特異條帶 。ATGC*隨機分布 ,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 。
④避免引物內部出現二級結構 ,避免兩條引物間互補 ,特別是3'端的互補 ,否則會形成引物二聚體 ,產生非特異的擴增條帶 。
⑤引物3'端的堿基 ,特別是末及倒數第二個堿基 ,應嚴格要求配對 ,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗 。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點 , 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點 , 這對酶切分析或分子克隆很有好處 。
⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性 。
引物量 :每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol ,以*引物量產生所需要的結果為好 ,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增 ,且可增加引物之間形成二聚體的機會 。

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