VE Elisa Kit斑點免疫金銀染色法實驗原理

試劑及材料

1. NC膜

2. 20mol/L ，pH7.6 PBS

3. BSA

4. 定影液 ：20% 。

5. 電泳儀和電轉儀

6. 其它試劑同上

操作方法

1. 用微量加樣器在NC膜上直接點樣1-2ml(若抗原含量少 ，可重複點樣) ，或經轉移電泳將抗原吸附在NC膜上 ，自然幹燥;

2. 將點樣後的NC膜浸入含5%BSA和0.05% NaN3的20mol/L ，pH7.6 PBS內 ，37℃ ，30min ，以封閉未飽和的蛋白質結合位點;

3. 用含0.1%BSA的TBS洗三次 ，每次5min;滴加適當稀釋的一抗(1-2mg/ml ，用含0.1%BSA和正常羊或兔血清的TBS稀釋) ，陰性對照用稀釋液代替抗體 ，在室溫下 ，反應2h;

4. 用含0.1%BSA的TBS洗三次，每次5min後 ，將NC膜浸入金標二抗溶液中(金標抗體用含0.4%明膠和0.1%BSA的TBS適當稀釋) 。反應時間視金標抗體的稀釋度而定 ：一般1 ：25稀釋(OD520 nm值約為0.2) ，反應時間為2h;1 ：100-1 ：200稀釋(OD520 nm值約為0.005) ，反應時間為16h;

5. TBS衝洗，即可觀察結果 。此過程為dot-IGS 。

6. 需要是可繼續進行銀顯色反應 ，行dot-IGSS ：將金標抗體染色後的NC膜 ，用TBS洗三次 ，每次5min ，再用蒸餾水洗滌兩次以去除Cl-  ，浸入0.2mol/L ，pH3.5枸櫞酸緩衝液內2min;

7. 移入銀顯色液中 ，避光顯色5-10min後 ，再移入定影液中 ，定影5min;

8. 自來水衝洗 ，自然幹燥;

結果觀察

dot-IGS ：在NC膜上呈粉紅色;dot-IGSS ：在NC膜上呈棕黑色 。

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