1. 血清 :室溫血液自然凝固10-20分鍾 ,離心20分鍾左右(2000-3000轉/分) 。仔細收集上清 ,保存過程中如出現沉澱 ,應再次離心 。
2. 血漿 :應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑 ,混合10-20分鍾後 ,離心20分鍾左右(2000-3000轉/分) 。仔細收集上清 ,保存過程中如有沉澱形成 ,應該再次離心 。
3. 尿液 :用無菌管收集 ,離心20分鍾左右(2000-3000轉/分) 。仔細收集上清 ,保存過程中如有沉澱形成 ,應再次離心 。胸腹水 、腦脊液參照實行 。
4. 細胞培養上清 :檢測分泌性的成份時 ,用無菌管收集 。離心20分鍾左右(2000-3000轉/分) 。仔細收集上清 。檢測細胞內的成份時 ,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液 ,細胞濃度達到100萬/ml左右 。通過反複凍融 ,以使細胞破壞並放出細胞內成份 。離心20分鍾左右(2000-3000轉/分) 。仔細收集上清 。保存過程中如有沉澱形成 ,應再次離心 。
5. 組織標本:切割標本後 ,稱取重量 。加入一定量的PBS ,PH7.4 。用液氮迅速冷凍保存備用 。標本融化後仍然保持2-8℃的溫度 。加入一定量的PBS(PH7.4) ,用手工或勻漿器將標本勻漿充分 。離心20分鍾左右(2000-3000轉/分) 。仔細收集上清 。分裝後一份待檢測 ,其餘冷凍備用 。
6. 標本采集後盡早進行提取 ,提取按相關文獻進行 ,提取後應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗 ,可將標本放於-20℃保存 ,但應避免反複凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品 ,因NaN3抑製辣根過氧化物酶的(HRP)活性 。
操作步驟 :
標準品的稀釋與加樣
:在酶標包被板上設標準品孔10孔
,在*
、第二孔中分別加標準品100μl
,然後在*
、第二孔中加標準品稀釋液50μl
,混勻
;然後從*孔
、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔
,再在第三
、第四孔分別加標準品稀釋液50μl
,混勻
;然後在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉
,再各取50μl分別加到第五
、第六孔中
,再在第五
、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul
,混勻
;混勻後從第五
、第六孔中各取50μl分別加到第七
、第八孔中
,再在第七
、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl
,混勻後從第七
、第八孔中分別取50μl加到第九
、第十孔中
,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl
,混勻後從第九第十孔中各取50μl棄掉
。(稀釋後各孔加樣量都為50μl
,濃度分別為60 mIU/ml
,40 mIU/ml
,20 mIU/ml
,10 mIU/ml
, 5mIU/ml)
。
加樣
:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑
,其餘各步操作相同)、待測樣品孔
。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然後再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5倍)
。加樣將樣品加於酶標板孔底部
,盡量不觸及孔壁
,輕輕晃動混勻
。
溫育
:用封板膜封板後置37℃溫育30分鍾
。
配液
:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋後備用
。
洗滌
:小心揭掉封板膜
,棄去液體
,甩幹
,每孔加滿洗滌液
,靜置30秒後棄去
,如此重複5次
,拍幹
。
加酶
:每孔加入酶標試劑50μl
,空白孔除外
。
溫育
:操作同3
。
洗滌
:操作同5
。
顯色
:每孔先加入顯色劑A50μl
,再加入顯色劑B50μl
,輕輕震蕩混勻
,37℃避光顯色15分鍾.
終止
:每孔加終止液50μl
,終止反應(此時藍色立轉黃色)
。
測定
:以空白空調零
,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)
。 測定應在加終止液後15分鍾以內進行
。
注意事項 :
試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鍾後方可使用
,酶標包被板開封後如未用完
,板條應裝入密封袋中保存
。
濃洗滌液可能會有結晶析出
,稀釋時可在水浴中加溫助溶
,洗滌時不影響結果
。
各步加樣均應使用加樣器
,並經常校對其準確性
,以避免試驗誤差
。一次加樣時間控製在5分鍾內
,如標本數量多
,使用排槍加樣
。
請每次測定的同時做標準曲線,做複孔
。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大於標準品孔*孔的OD值)
,請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)後再測定
,計算時請zui後乘以總稀釋倍數(×n×5)
。
封板膜隻限一次性使用
,以避免交叉汙染
。
底物請避光保存
。
嚴格按照說明書的操作進行
,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
所有樣品
,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理
。
本試劑不同批號組分不得混用
。
本試劑僅供研究使用 目的:本試劑盒用於測定小鼠血清 ,血漿及相關液體樣本中β氨基己糖苷酶A(β-Hex A)的活性 。
實驗原理 :
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠β氨基己糖苷酶A(β-Hex A)水平 。用純化的小鼠β氨基己糖苷酶A(β-Hex A)抗體包被微孔板 ,製成固相抗體 ,往包被單抗的微孔中加入β氨基己糖苷酶A(β-Hex A) ,再與HRP標記的β氨基己糖苷酶A(β-Hex A)抗體結合 ,形成抗體-抗原-酶標抗體複合物 ,經過*洗滌後加底物TMB顯色 。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色 ,並在酸的作用下轉化成zui終的黃色 。顏色的深淺和樣品中的β氨基己糖苷酶A(β-Hex A)呈正相關 。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值) ,通過標準曲線計算樣品中小鼠β氨基己糖苷酶A(β-Hex A)的濃度 。
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