老哥俱乐部

实验报告：

一
、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次

，将组织剪成1mm3左右大小

；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s
，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置
，重复此步骤2-3次
，直至组织被消化；

4

、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清
，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶
，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养
；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养
；二、免疫荧光鉴定：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基
，用温育的PBS冲洗细胞2次

，每次10min
，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min

；

2、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5
、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介
：

兔胚胎羊膜分离自羊膜组织；羊膜为单层上皮细胞互相连接构成的薄膜

。单层上皮细胞具有分泌羊水的作用。随着胚胎的生长发育，羊膜与绒毛密切紧贴
，形成胎膜。胎膜随着羊膜腔逐渐扩大而呈半透明的薄膜，无血管
，富有韧性（胎膜也就是羊膜腔的囊壁）。羊膜腔内充满的液体为羊水。羊膜仅覆盖在胎盘的儿体面
，并不深入胎盘组织中，随着妊娠的进展羊膜腔逐渐扩大，占据整个子宫腔，羊膜是胎膜内一层
，是一层半透明的薄膜，与覆盖在胎盘

、脐带的羊膜层相连接
。羊膜是胎盘的内层，与人眼结膜组织结构相似，含有眼表上皮细胞，包括结膜细胞和角膜上皮细胞生长所需要的物质
，其光滑
，无血管、神经及淋巴
，具有一定的弹性
，厚0.02~0.5mm，在电镜下
，其分为五层：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层，羊膜基底膜和羊膜基质层含有大量不同的胶元，主要为i、iii、iv、v、vii型胶原和纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等成份，正是这些成份使羊膜可以充当“移植的基底膜"而发挥一种新的健康合适的基质。羊膜细胞主要由羊膜上皮细胞和羊膜间充质细胞组成，均具有多分化潜能，可转化为神经元，且还有合成、释放生物活性物质和神经营养因子的功能。

方法简介：

公司实验室分离的兔羊膜胚胎采用-胶原酶联合消化法制备而来制备而来
，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的兔羊膜胚胎经Cytokeratin-18免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV
、HCV、支原体、细菌
、酵母和真菌等。

培养信息：

包被条件 PLL（0.1mg/ml）

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 成纤维细胞样

传代特性 可传3-5代左右

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液
、浑浊等现象
，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书
，了解细胞相关信息
，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题
，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h
。

4. 贴壁细胞可以消化


，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min
，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，，用新鲜的*培养基重悬细胞
，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养

。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况
，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况
，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注
：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿

。

公司正在出售的产品
：

猪肝细胞生长因子(HGF)ELISA 试剂盒

Human Ureaplasma urealyticum aibody (UU-Ab) ELISA Kit 人解脲脲原体抗体(UU-Ab)检测试剂盒

PorcineEndothelialniicoxidesyhase3,eNOS-3ELISAKit 猪内皮型合成酶3(eNOS-3)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforAlpha-bungarotoxin,Alpha-BGTELISAKitα-银环蛇毒素

血液赖(lysine)含量化学比色法定量检测试剂盒20次

NudeMouseProteinPhosphatase,PPELISAKit裸鼠蛋酸酶(PP)检测试剂盒规格：96T/48T

FZD5重组人 Frizzled-5 / FZD5 蛋白 (His & Fc 标签) Protein

神经生长因子(NGF)重组蛋白 Recombinant Nerve Growth Factor (NGF)

TRIP10重组人 TRIP10 / Cip4 蛋白 Protein

IL3RA Protein Human 重组人 IL3RA / CD123 蛋白

HA Protein Influenza 重组甲型流感 H1N1 (A/Ohio/07/2009) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 蛋白

神经生长因子(NGF)重组蛋白 Recombinant Nerve Growth Factor (NGF)

IL3RA Protein Human 重组人 IL3RA / CD123 蛋白

FZD5重组人 Frizzled-5 / FZD5 蛋白 (His & Fc 标签) Protein

HA Protein Influenza 重组甲型流感 H1N1 (A/Ohio/07/2009) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 蛋白

TRIP10重组人 TRIP10 / Cip4 蛋白 Protein

豚鼠促肾上腺皮质激素(ACTH)检测试剂盒

，英文名： ACTH ELISA Kit

Many people immunoglobulin receptor (poly-IgR) ELISA Kit 人多免疫球蛋白受体(poly-IgR)检测试剂盒

rabbitN-terminalprocollagenⅢpropeptide,PⅢNPELISAKit 兔子Ⅲ型前胶原肽(PⅢNP)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforBeta-HexA(MouseBeta-hexosaminidaseA)ELISAKit小鼠β氨基己糖苷酶A

细菌细胞色素氧化酶活性比色法定量检测试剂盒20次

rabbitHyaluronicacid,HAELISAKit兔子透明质酸(HA)检测试剂盒规格：96T/48T

兔羊膜胚胎细胞人重去甲上腺素(NE-B)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

人血管生长因子(TAF)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

人相关抗原(TAA)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

人特异性抗原(TSA)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装