老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小

；

2
、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s

，置37℃条件下消化10min

，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液

，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置
，重复此步骤2-3次
，直至组织被消化；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清
，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬

，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ 
，5％CO2 培养箱中培养
；

5、差速贴壁1h后
，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养
；二
、免疫荧光鉴定
：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在4℃条件下
，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3
、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次

，每次10min
，按1
：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次
，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

人输尿管平滑肌分离自输尿管组织
；输尿管上接肾盂
，下连膀胱，是一对细长的管道
，呈扁圆柱状
，位于腹膜后，为一肌肉粘膜所组成管状结构，沿腰大肌内侧的前方垂直下降进入骨盆
。输尿管有三个狭窄部：一个在肾盂与输尿管移行处(输尿管起始处)；一个在越过小骨盆入口处；后一个在进入膀胱壁的内部。这些狭窄是结石、及坏死组织容易停留的部位
。输尿管——膀胱连接处有一种特殊结构，即瓦耳代尔鞘，它能有效地防止膀胱内尿液返流到输尿管
。临床上将输尿管分为上、中、下三段，也可称为腹段
、盆段、膀胱段
。其中
，腹段自肾盂输尿管交界处，到跨越髂动脉处；盆段，自髂动脉到膀胱壁

；膀胱段，自膀胱壁内斜行至膀胱粘膜、输尿管开口。输尿管管壁分为4层，黏膜层
、固有层

、肌层、外膜。黏膜层表面为移行上皮，约有4-5层细胞
；固有层由细密的结缔组织构成，内含胶原纤维和少量弹性纤维；输尿管肌层主要由内纵和外环两层平滑肌组成


；外膜为疏松结缔组织
，营养血管由外膜进入输尿管。输尿管有较厚的平滑肌层，可作节律性的蠕动
，使尿液不断的流入膀胱

。因此对输尿管平滑肌运动的研究，是尿动力学的重要研究方向。

方法简介：

实验室分离的人输尿管平滑肌采用胶原酶消化法制备而来
，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶
。

质量检测

实验室分离的人输尿管平滑肌经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV
、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等
。

培养信息：

培养基：基础培养基，含FBS

、生长添加剂
、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：长梭形

传代特性：可传3-5代左右
，3代以内状态佳

消化液：0.25%

培养条件
：气相：空气，95%；CO2
，5%

人输尿管平滑肌体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的佳培养状态。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好
，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系

。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息
，如细胞形态
、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等
，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态

。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min

，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，
，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因
，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿
。

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