老哥俱乐部

细胞简介：

人角膜成纤维分离自眼角膜组织；角膜位于眼球前壁的一层透明膜
，约占纤维膜的前1/6，从后面看角膜呈正圆形
，从前面看为横椭圆形
。角膜厚度各部分不尽相同
，中央部薄。角膜有十分敏感的神经末梢，如有外物接触角膜
，眼睑便会不由自主地合上以保护眼睛
。为了保持透明，角膜并没有血管，透过外界空气、泪液及房水获取养份及氧气
。角膜分为五层
，由前向后依次为
：上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮细胞层。成纤维细胞（Fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性
，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下
，它可以实现跟纤维细胞的互相转化
；成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用
。刚分离的角膜成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀
，散在生长，不聚集成团

；细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态
，细胞排列紧密
，有的交叉重叠生长
，平坦
、胞体较大，细胞质透明

，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。细胞融合，并彼此连接成网状；细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。角膜成纤维细胞在生理条件下的主要功能包括：构造和维持角膜的正常形态
，合成和释放细胞外基质以及组织损伤后及时大量聚集修复损伤组织。

方法简介


：

公司实验室分离的人角膜成纤维采用-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法制备而来
，细胞总量约为5×10?cells/瓶
。

质量检测

公司实验室分离的人角膜成纤维经Vimentin免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV
、支原体、细菌、酵母和真菌等
。

培养信息：

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 成纤维细胞样

传代特性 可传5代左右；3代以内状态佳

消化液 0.25%

培养条件 气相
：空气
，95%；CO2，5%

实验报告

：

一、分离与培养：

1
、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s
，置37℃消化10 min后
，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置
，重复此步骤2-3次，直至组织被消化
；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min，弃去上清
，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5

、差速贴壁1h后
，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定
：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2
、PBS冲洗细胞2次，每次10min

，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3
、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min
；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h
；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照
。

公司正在出售的产品
：

小鼠硫氧还蛋白还原酶(xR)ELISA 试剂盒

Neuroophic factor of rat glial cell line derived (GDNF) ELISA Kit 大鼠胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)检测试剂盒

Humanneurofilameprotein,NFELISAKit 人神经丝蛋白(NF)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

HumanactivatedproteinC,APC检测试剂盒人活化蛋白C(APC)检测试剂盒规格
：96T/48T

脂质过氧化物反式十八碳四烯酸(cis-parinaricacid)ELISA定量测定试剂盒48/96次

MouseAngiotensinconveingenzyme,ACEELISAKit小鼠血管紧张素转化酶(ACE)检测试剂盒规格：96T/48T

HA重组甲型流感 H9N2 (A/Guinea fowl/Hong Kong/WF10/99) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白 Protein

rh-EGF(Recombinant Epidermal growth factor 0.1mgrh-EGF(Recombinant Epidermal growth factor)

SERPINF2重组人 SerpinF2 / SERPINF2 蛋白 Protein

CGA Protein Human 重组人 FSH alpha / TSH alpha / CGA 蛋白

HMGB1 Protein Human 重组人 HMGB1 / HMG1 蛋白 (Fc 标签)

rh-EGF(Recombinant Epidermal growth factor 0.1mgrh-EGF(Recombinant Epidermal growth factor)

CGA Protein Human 重组人 FSH alpha / TSH alpha / CGA 蛋白

HA重组甲型流感 H9N2 (A/Guinea fowl/Hong Kong/WF10/99) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白 Protein

HMGB1 Protein Human 重组人 HMGB1 / HMG1 蛋白 (Fc 标签)

SERPINF2重组人 SerpinF2 / SERPINF2 蛋白 Protein

小鼠天门冬酸基转移酶(AST)检测试剂盒 96T/48T

Human chondroitin sulfate (CS) ELISA Kit 人软骨素(CS)检测试剂盒

HumanMannoseELISAKit 人甘露糖(Mannose)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

ChickenansformingGrowthfactorβ2,TGF-β2检测试剂盒鸡转化生长因子β2(TGF-β2)检测试剂盒规格
：96T/48T

载玻片细胞RyR受体蛋白表达荧光显微镜检测试剂盒10/20次

Mouseesogen,EELISAKit小鼠雌激素(E)检测试剂盒规格：96T/48T

人角膜成纤维细胞小鼠特异生长因子/相关因子(TSGF)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠坏死因子样弱凋亡因子（TWEAK）检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠坏死因子相关凋亡诱导配体4(AIL-R4)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠坏死因子相关凋亡诱导配体3(AIL-R3)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系
。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基
、血清比例
、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面

，显微镜下观察细胞状态
。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片
，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min
，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞
，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用


。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。