實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

大鼠腎小球係膜分離自腎小球組織 ；腎小球是腎元中的用於將血液過濾生成原尿的一團毛細血叢 ，被鮑氏囊所包裹 ，是尿液形成的重要構造 。血液經由入球小動脈進入腎小球 。腎小球內的微血管不像其他微血管 ，匯流入靜脈 ，而是流入出球小動脈。在腎小球內 ，微血管受到高壓 ，而加速了超濾作用（hyperfiltration）的進行 。微血管中的血液經由超濾作用之後 ，形成濾液 ，滲入鮑氏囊內 。腎小球與鮑氏囊合稱為腎小體 ，腎小球的過濾速率便稱為腎小球過濾率 。腎小球係膜是位於腎小球毛細血管袢之間的一種特殊間充質 ，由係膜細胞和係膜基質組成 。腎小球係膜細胞是腎小球內非常活躍的細胞 ，具有分泌細胞基質 、產生細胞因子 、吞噬和清除大分子物質及類似平滑肌細胞收縮的功能 。腎小球係膜細胞增生和基質的過多產生是多種腎小球腎炎的主要病理表現 。腎小球係膜細胞的培養是研究係膜擴張 、瘢痕形成和腎小球硬化的理想方法 。係膜細胞的主要作用可能有 ：①收縮作用 ，入球小動脈和出球動脈的收縮作用受係膜細胞的調節 ，以影響毛細血管袢的內壓和濾過率 ；②支持作用 ，它填充於毛細血管袢之間 ，支持毛細血管的位置 ；③吞噬作用 ，能吞噬被阻留在基膜內的大分子物質和蛋白質 ；④分泌腎素，在腎缺血或免疫複合物沉積時 ，係膜細胞增生且分泌腎素。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的大鼠腎小球係膜采用機械研磨法結合不同孔徑不鏽鋼網篩過濾後使用膠原酶消化製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的大鼠腎小球係膜經α-SMA免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

包被條件 PLL（0.1mg/ml）

培養基 含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 成纖維細胞樣

傳代特性 可傳1-2代

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

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