實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min ；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

大鼠精原分離自睾丸組織 ；睾丸呈微扁的卵圓形 ，表麵光滑 ，覆蓋著鞘膜髒層 ；深部是質地堅韌的白膜 ，在睾丸後緣增厚並進入睾丸 ，形成睾丸縱膈 ，縱膈發出許多睾丸小隔深入睾丸實質 ，將實質分為睾丸小葉 ，數量約為100～200 。每個小葉內約有2～4條生精小管 ，具有產生精子的作用 ；生精小管之間的結締組織中有睾丸間質細胞 ，具有產生雄激素的作用 。生精小管首先匯合成為精直小管(也稱直精小管) ，精直小管進入睾丸縱膈形成睾丸網 ，之後睾丸網發出12～15條輸出小管通過睾丸後上緣進入附睾 。生精小管的生精上皮是精子產生的地方 ，由生精細胞和支持細胞構成 ，成人的生精小管有30～70cm長 。精子的產生過程包括生精細胞的分化 、支持細胞的作用 、雄激素的調節等 。生精細胞並不是一種細胞 ，它是多種細胞的統稱 ，包括精原細胞 、初級精母細胞 、次級精母細胞 、精子細胞 、精子 。前者依次發育分化為後者 ，且依次從生精上皮的基部到管腔麵排列 ，終形成精子進入到管腔之中 ，並借助生精上皮外側的肌樣細胞的收縮作用向下一級管腔移動 。精原細胞是指由睾丸精子管上皮的原始生殖細胞經過多次有絲分裂而形成的細胞 。原始的胚細胞經分化形成精原細胞 ，精原細胞經複製形成初級精母細胞，初級精母細胞經過減數次分裂後形成次級精母細胞 ，再經過減數次分裂形成精細胞 。精細胞經過變形終形成精子 。精原細胞屬於雄性生殖細胞的早期發育階段 ，能不斷地進行有絲分裂 ，增加細胞數量 ，並分化為精母細胞。精原細胞貼近基膜 ，細胞呈圓形 ，核大而圓 ，梁色深 。精原細胞在男性的一生中具有幾乎無限分裂的能力 ，而且分裂過程中能夠保持原有的基因性狀不變 。在增殖過程中 ，通過精原細胞的分裂和分化 ，由精原細胞產生精母細胞 ，進入成熟分裂 ，因而通過增殖可大大增加精母細胞的數量 。按理論推算 ，一個精原細胞通過數次細胞分裂 ，可形成上百個初級精母細胞 。但在生精過程早期 ，生精細胞很易發生變性 ，故實際上少於這個數字 。在精原細胞的增殖過程中 ，有一部分Ad型精原細胞不再繼續分裂 ，而是保留下來 ，成為新的精原幹細胞 ，因此通過增殖不僅能使精原幹細胞不斷得到更新 ，且能使精原幹細胞保持一定數量 ，從而使精子的產生持續地進行下去 ，不會枯竭 。

方法簡介 ：

實驗室分離的大鼠精原采用混合酶多步消化法製備而來 ，細胞總量約為5×10⁵cells/瓶 。

質量檢測

實驗室分離的大鼠精原經AP(堿性磷酸酶)免疫組化染色鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

培養基 ：含FBS、生長添加劑 、GDNF 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 ：每2-3天換液一次

生長特性 ：貼壁

細胞形態 ：圓形 、橢圓形

傳代特性 ：可傳2-3代左右

消化液 ：0.25%

培養條件 ：氣相 ：空氣 ，95% ；CO2，5%

大鼠精原體外培養周期有限 ；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養 ，以此保證該細胞的佳培養狀態 。

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

兔子補體片斷3a(C3a)試劑盒   96T/48T

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Rat epinephrine (EPI) ELISA Kit 大鼠(EPI)試劑盒

Humanbonealkalinephosphatase,BALPELISAKit 人骨堿性0酸酶(BALP)試劑盒 96T/48T 進口分裝

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bovine Insulin protein 牛胰島素蛋白 10mgbovine Insulin protein 牛胰島素蛋白

GOLM1 Protein Human 重組人 GOLM1 / GP73 蛋白

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BMPR1B重組人 BMPR1B / ALK-6 (149-502) 蛋白 (His & GST 標簽) Protein

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Mouse beta glucosidase (beta -glucosidase) ELISA Kit 小鼠β葡糖苷酶(β-glucosidase)試劑盒

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通用型番茄瘡痂病辣椒斑點病菌(Xahomonascampesispv.vesicatoria;Xcv)試劑盒20次

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