實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

大鼠結腸黏膜上皮分離自結腸組織 ；結腸在右髂窩內續於盲腸 ，在第3骶椎平麵連接直腸 。結腸分升結腸 、橫結腸 、降結腸和乙狀結腸4部分，大部分固定於腹後壁 ，結腸的排列酷似英文字母“M" ，將小腸包圍在內 。結腸橫切麵由內到外依次為 ：黏膜（上皮層 、固有層 、黏膜肌層） ，黏膜下層（疏鬆結締組織） ，肌層（內環形 、外縱行兩層平滑肌） ，外膜（纖維膜或漿膜） 。腸黏膜上皮細胞是機體內外環境的重要屏障 ，持續暴露於大量抗原中 ，也是機體麵對病原微生物的道防線 。因此 ，腸黏膜上皮細胞除有吸收 、分泌和轉運等重要生理功能之外 ，在黏膜先天性和獲得性免疫防禦機製中也起著重要作用 。腸黏膜上皮細胞作為首先接觸抗原的細胞，在黏膜免疫反應的起始階段發揮關鍵作用 ，它決定黏膜免疫反應的發生 、性質和強度 。探討正常結腸黏膜上皮細胞的分離 、體外培養方法 ，為研究腸黏膜上皮細胞以及與腸黏膜相關疾病建立合適的細胞模型 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的大鼠結腸黏膜上皮采用先機械分離法 、後膠原酶消化法並通過上皮細胞專用培養基培養篩選製備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的大鼠結腸黏膜上皮經Cytokeratin-18免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

包被條件 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基 含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 上皮細胞樣

傳代特性 可傳1-2代

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液 、渾濁等現象，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

大鼠酶原顆粒膜糖蛋白(GP2)檢測試劑盒  ，英文名 ： GP2 ELISA Kit

Mouse insulin like growth factor 2 (IGF-2) ELISA Kit 小鼠胰島素樣生長因子2(IGF-2)檢測試劑盒

RatAmylinELISAKit 大鼠胰澱素(Amylin)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforGelsolinELISAKit大鼠凝溶膠蛋白

細胞甘油三酯(iglyceride)含量酶連續循環反應比色法定量檢測試劑盒20次

Ratsolubleclusterofdiffereiation14,sCD14ELISAKit大鼠可溶性CD14(sCD14)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

HA重組甲型流感 H15N2 (A/Australian shelduck/Western Australia/1756/1983) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白 Protein

PAI-1 纖溶酶原激活物抑製因子 0.5mgPAI-1 纖溶酶原激活物抑製因子

ICOSLG重組人 ICOS Ligand / B7-H2 / ICOSLG 蛋白 Protein

ESM1 Protein Human 重組人 ESM1 / Endocan 蛋白

ANGPT2 Protein Human 重組人 Angiopoietin-2 / ANG2 蛋白 (Fc 標簽)

PAI-1 纖溶酶原激活物抑製因子 0.5mgPAI-1 纖溶酶原激活物抑製因子

ESM1 Protein Human 重組人 ESM1 / Endocan 蛋白

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ICOSLG重組人 ICOS Ligand / B7-H2 / ICOSLG 蛋白 Protein

小鼠壞死因子α(TNF-α)ELISA 試劑盒 96T/48T

Human platelet aibody IgG/M/A (PA-IgG/M/A) ELISA Kit 人抗血小板抗體IgG/M/A(PA-IgG/M/A)檢測試劑盒

Humandeubiquitinatingenzyme,DUBELISAKit 人泛素分解酶(DUB)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforABP(HumanAndrogenBindingProtein)ELISAKit人雄激素結合蛋白

合成酶(NOS)總活性終點比色法定量檢測試劑盒50/100次

MouseN-terminalpro-brainnaiureticpeptide,-proBNPELISAKit小鼠N端前腦素(-proBNP)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

大鼠結腸黏膜上皮細胞小鼠癌標誌物CA125ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠癌標誌物-CA153ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠胃腸癌標誌物CA199ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠血紅素氧合酶1(HO-1)ELISAKit   ELISA.   96T/48T