老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小
；

2
、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液
，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次
，直至组织被消化
；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min，弃去上清
，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬

，接种于25cm2培养瓶

，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养
；

5、差速贴壁1h后

，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二

、免疫荧光鉴定
：

1

、待心房肌细胞生长至80%融合时
，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min

；

2、PBS冲洗细胞2次
，每次10min
，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3

、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗

，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次
，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h

；

6、用PBS冲洗3次
，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照

。

细胞简介
：

大鼠肠系膜上动脉内皮分离自肠系膜动脉组织
；肠道指的是从胃幽门至门的消化管
。肠是消化管中最长的一段
，也是功能最重要的一段。哺乳动物的肠包括小肠、大肠和直肠3大段

。大量的消化作用和几乎全部消化产物的吸收都是在小肠内进行的，大肠主要浓缩食物残渣，形成粪便，再通过直肠经门排出体外。肠道堪称身体最劳累的器官——每天不停地消化
、吸收食物
，以提供足够的养分，其实它的功能还远不止此——它还是机体内最大的微生态系统
。肠系膜动脉由背大动脉发出的走行在肠系膜内
，分布于消化管的动脉

。分成肠系膜上动脉和肠系膜下动脉
。前者主要分布于小肠左侧，后者分布于结肠、大肠、泄殖腔等处
。内皮细胞或血管内皮是一薄层的专门上皮细胞，由一层扁平细胞所组成
。它形成血管的内壁
，是血管管腔内血液及其他血管壁（单层鳞状上皮）的接口
。内皮细胞是沿着整个循环系统，由心脏直至最小的微血管

。

方法简介

：

实验室分离的大鼠肠系膜上动脉内皮采用-胶原酶联合消化法制备而来

，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

实验室分离的大鼠肠系膜上动脉内皮经CD31免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上
，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等
。

培养信息
：

包被条件：PLL（0.1mg/ml）
，明胶（0.1%）

培养基
：含FBS
、生长添加剂、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：内皮细胞样

传代特性
：可传2-3代

消化液：0.25%

培养条件：气相：空气，95%
；CO2，5%

大鼠肠系膜上动脉内皮体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的培养状态。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好
，培养液是否有漏液
、浑浊等现象

，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态
、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等
，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面
，显微镜下观察细胞状态。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象
。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养
。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态
，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1
：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

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：

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