老哥俱乐部

本产品具有下列特点:

1.操作简便、快捷。可直接加入到检测平板。在96-孔板中检测时,无需洗涤或收获细胞,免去溶解步骤
。

2. 无放射性。不需要配制液闪混合物,也不需要处理废弃物。

3. 与MTT相比,使用更安全。不需要使用挥发性的有机溶剂来溶解甲臜产物
。

4. 操作灵活,与MTT不同,平板读数后可放回温箱继续孵育,使颜色进一步生成
。

商品属性
：

产品英文名称
：Human CCL4 Protein (Animal-Free)

产品中文名称

：重组人趋化因子配体4（无动物源）（CCL4）

规格：5 μg/20 μg/100 μg/1 mg

货号：EY-01X8789
用途：仅供科研研究实验

特点&优势:

表达宿主:大肠杆菌

种属:人

序列:氨基酸序列来源于：人趋化因子配体4（Ala24-Asn92）。

活性:通过其对转染人 CCR5的 BaF3细胞的化学吸引能力来衡量。 ED₅₀的这种效应小于10 ng/mL。

纯度:>98%，使用SDS-PAGE检测

通过LAL法测定
，每微克蛋白里内毒素含量<0.1 EU
。

产品形式:冻干粉，冻干缓冲液为无菌的50 mM Tris and 150 mM NaCl, pH 8.5。

使用中注意事项:开盖使用前，请先离心
。本产品为冻干粉
，推荐用该产品配套的Reconstit动겸动

背景

C-C 基序趋化因子配体4(CCL4)是一种7.66 kDa 的细胞因子
，含有69个氨基酸残基
。CCL4又称巨噬细胞炎性蛋白 -1β (MIP-1β)
，主要由中性粒细胞、单核细胞、 B 细胞、 T 细胞
、成纤维细胞

、内皮细胞和上皮细胞分泌
。

操作步骤：

(一)获得目的基因

1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段
。

2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

(二)构建重组表达载体

1
、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段
。

2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体
。

(三)  获得含重组表达质粒的表达菌种

1

、 将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定


。

2
、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞
。

(四)诱导表达

1
、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃过夜培养。

2、按1∶50比例稀释过夜菌,一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大约需3hr)。

3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。

4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀,用100μl 1%SDS重悬,混匀, 70℃10min。

5
、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。

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