產品僅供研究使用 ，不適用於人類或臨床診斷
商品屬性 ：

產品英文名稱 ：Mouse RANKL protein

產品中文名稱 ：重組小鼠NF-κB受體激活因子配體RANKL

規格 ：2 μg/10 μg/100 μg/1 mg

貨號 ：EY-01X8640
用途 ：僅供科研研究實驗

特點&優勢:

標簽:無標簽

表達宿主:大腸杆菌

種屬:小鼠

序列:氨基酸序列來源於 ： 小鼠RANKL (O35235)(Pro143-Asp316) 表達的蛋白片段 。

活性:檢測其與配體的結合能力 ，檢測的實驗類型為功能性ELISA 。包被的 1 μg/mL(100μl/孔)小鼠sRANKL可以結合人OPG(C-Fc) ，人OPG的EC50值為55 ng/mL 。 OPG為55 ng/mL

蛋白長度：重組小鼠sRANKL由174個氨基酸（N-Met）組成 ，預測分子量為19 kDa 。 在還原條件下 ，在SDS-PAGE中 ，小鼠sR動겸動

背景

RANKL是腫瘤壞死因子配體超家族成員11 ，也稱為核因子kappa-B受體激活因子的配體 ，骨保護素配體 ，TNFSF11 ，RANKL ，TRANCE ，OPGL和CD254, 在多種細胞中表達 ，如成骨細胞 ，成纖維細胞 ，活化的T淋巴細胞 ，以及骨髓間質細胞 。RANKL可以與誘騙受體OPG反應 ，並參與許多基礎生物學過程 ，例如充當T細胞與樹突狀細胞之間相互作用的調節因子 ，調節T- 細胞依賴的免疫效應 ，並可以增強高鈣血症的骨吸收 。重要的是 ，RANKL可以增強樹突狀細胞刺激初始T細胞的增殖能力 。

本產品具有下列特點:

 1.操作簡便 、快捷 。可直接加入到檢測平板 。在96-孔板中檢測時,無需洗滌或收獲細胞,免去溶解步驟 。

2. 無放射性 。不需要配製液閃混合物,也不需要處理廢棄物 。

3. 與MTT相比,使用更安全 。不需要使用揮發性的有機溶劑來溶解甲臢產物 。

4. 操作靈活,與MTT不同,平板讀數後可放回溫箱繼續孵育,使顏色進一步生成 。

操作步驟 ：

(一)獲得目的基因

1 、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上遊和下遊引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環獲得所需基因片段 。

2 、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成cDNA第一鏈,以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物 。

(二)構建重組表達載體

1 、載體酶切:將表達質粒用限製性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產物行瓊脂糖電泳後,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段 。

2 、PCR產物雙酶切後回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體 。

(三)  獲得含重組表達質粒的表達菌種

1 、 將連接產物轉化大腸杆菌DH5α,根據重組載體的標誌(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定 。

2 、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作 。否則應篩選更多克隆,重複亞克隆或亞克隆至不同酶切位點 。

3 、 以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞 。

(四)誘導表達

1 、挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養 。

2 、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中, 37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr) 。

3 、取部分液體作為未誘導的對照組,餘下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr 。

4 、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉澱,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min 。

5 、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析 。

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