產品僅供研究使用 ，不適用於人類或臨床診斷
商品屬性 ：

產品英文名稱 ：Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection kit

產品中文名稱 ：Annexin V-EGFP/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒

規格 ：20T/50T/100T

貨號 ：EY-01X8541
用途 ：僅供科研研究實驗

特點&優勢:

•  標準化 ，具有陽性對照 。解決凋亡檢測的非標準化問題

•  熒光強度和光穩定性更好 ；EGFP是FITC的替代物 ，熒光強度和光穩定性更好

•  適用於流式細胞術和熒光顯微鏡

保存建議:-20℃ ，避光保存12個月 。

運輸條件:藍冰運輸

背景

細胞凋亡（apoptosis）是一種基本生物學現象 ，指為維持內環境穩定 ，由基因控製的細胞自主的有序的死亡 ，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著必要的作用 。在正常活細胞中 ，磷脂酰（PS）位於細胞膜的內側 ，而在細胞凋亡的早期 ，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表麵 ，暴露在細胞外環境中 。膜聯蛋白V(Annexin V) 是一種分子量為35~36KDa的鈣離子依賴型磷脂結合蛋白 ，能與PS高親和力特異性結合 。通過熒光素或者標記Annexin V即可簡單快速地直接檢測出細胞早期凋亡情況 。 碘化丙啶（propidine iodide ，PI）是一種核酸染料 ，它不能透過完整的細胞膜 ，而早期凋亡細胞的細胞膜是完好的 ，對PI有拒染性 。但在凋亡中晚期的細胞和死細胞 ，PI能透過細胞膜而使細胞核染上 。因此將Annexin V 與PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來 。PI可以被488,532或546nm激光線激發 ，並發出紅色熒光 。

本產品具有下列特點:

 1.操作簡便 、快捷 。可直接加入到檢測平板 。在96-孔板中檢測時,無需洗滌或收獲細胞,免去溶解步驟 。

2. 無放射性 。不需要配製液閃混合物,也不需要處理廢棄物 。

3. 與MTT相比,使用更安全。不需要使用揮發性的有機溶劑來溶解甲臢產物 。

4. 操作靈活,與MTT不同,平板讀數後可放回溫箱繼續孵育,使顏色進一步生成 。

操作步驟 ：

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上遊和下遊引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環獲得所需基因片段 。

2 、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成cDNA第一鏈,以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物 。

(二)構建重組表達載體

1 、載體酶切:將表達質粒用限製性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產物行瓊脂糖電泳後,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段 。

2 、PCR產物雙酶切後回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體 。

(三)  獲得含重組表達質粒的表達菌種

1 、 將連接產物轉化大腸杆菌DH5α,根據重組載體的標誌(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定 。

2 、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作 。否則應篩選更多克隆,重複亞克隆或亞克隆至不同酶切位點 。

3 、 以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞 。

(四)誘導表達

1 、挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養 。

2 、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中, 37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr) 。

3 、取部分液體作為未誘導的對照組,餘下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr 。

4 、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉澱,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min 。

5 、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析 。

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