老哥俱乐部

使用方法:
一
、样品 DNA 的制备
用自选方法提取 Cps DNA。注意
：DNA 纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品 DNA，后面的 PCR 再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备 Cps 标准曲线（以 10-10E6 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行
，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照
，只提供没有传染性的、可以直接使用的 DN**段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 6
，5，4
，3，2 和 1 号。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用 TE 缓冲液或超纯水 10 倍梯度稀释到10E7 拷贝/μL（注
：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10E7拷贝/μL，建议每次稀释 10 倍，梯度稀释至 10E7 拷贝/μL）。
4. 在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的 Cps 阳性对照(上步稀释所得)
，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。
5. 换枪头，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 10E5拷贝/μL 的阳性对照。
6. 换枪头
，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中
，重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。
7. NC 管中不加任何阳性对照。
8. 从 1-6 号管中分别取 5 μL 和待测样品一起进行定量 PCR（见下步）
，每个样品做 3 次重复
。PCR 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 PCR Ct 值，并以之为纵轴

，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线

。

参数规格
：

储存条件

：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清

：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆
：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测
，请按一次用量分装
，冻存于-20℃，避免反复冻融
，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
​
检测步骤：
一
、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)
、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表
：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量
，加入一适当体积洁净离心管中
，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL
，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号
。报告基团
：设置为FAM。淬灭基团
：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

溴1-苄-3-甲咪唑：253.141- benzyl -3- methyl bromide
： C11H13BrN2

4--3-硝三氟甲

：4- amino -3- nitro three f：400-98-6

硝酸布康唑
：474.79Nitric acid：64872-77-1 C19H18Cl3N3O3S

5-氟-2-硝甲
：155.135- -2- nitro toluene
：446-33-3 C7H6FNO2

3--2,6二溴吡：251.913- amino -2,6 dibromopyridine：39856-57-0 C5H4Br2N2

4-溴邻二甲
：185.064- bromide：583-71-1 C8H9Br

萘Naphthalene：128.17 C10H8
：91-20-3

醋可的松Cortisone acetate：402.47 C23H30O6：18357

1,3,5-三(炔丙氧代)：240.261,3,5- three (Que Bingji) benzene
：114233-80-6 C15H12O3

嗜热链球菌LAMP试剂盒小鼠 PDK / PDZ binding kinase / K 基因全长ORF克隆

人 FEN1 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签

小鼠 ATP5J2 基因全长ORF克隆

食蟹猴 TRAIL R4 / CD264 / TNFRSF10D 人细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

人 KNG1 / Kininogen 1 ELISA配对抗体

人 GMFB 基因全长ORF克隆 (表达载体), 带FLAG标签

甲型流感 H7N1 (turkey/Italy/4602/99) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全长ORF克隆 (密码子优化)(表达载体), 无标签

重组人 IFNα4 / IFNa4 / Interferon alpha-4 蛋白 (Fc 标签)

人 SNX4 基因全长ORF克隆

大鼠 HGF 基因全长ORF克隆

人 KRT6A 基因全长ORF克隆

人 CAV1 基因全长ORF克隆