老哥俱乐部

实验报告：
一、分离与培养
1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将成1mm3左右大小；
2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置
；
3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液
，混悬10s
，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置
，重复此步骤2-3次，直至组织*被消化；
 4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬
，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃
，5％CO2 培养箱中培养；
 5
、差速贴壁1h后
，吸出培养基
，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定
：
1、待心房肌细胞生长至80%融合时
，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min
，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；
 2

、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min

；
3
、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min
；
 4
、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；
5、PBS冲洗细胞3次
，每次10min，按1
：150的比例稀释抗α-actin的二抗

， 37℃条件下放置1h；
6
、用PBS冲洗3次
，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照
。

​

运输和保存
：
视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行
。
1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中
，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作
，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月
。
2)T-25培养瓶充满*培养基后进行常温运输
；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁
。

细胞培养的优点
：
1.研究的对象是活细胞
在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。
2.研究条件可以人为控制
pH
、温度、氧气
、二氧化碳
、张力等物理化学的条件
，可以根据实际需要进行人为的控制，同时
，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。
3.研究的样本可以达到比较均一性
通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。
4.研究内容便于观察
、检测和记录
采用各种研究技术：如倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等各种仪器设备

。
冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ （-20 ℃30 分钟*） → -80 ℃16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 储存
。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase储存
。*-20 ℃不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
培养操作：
1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀
。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟
，弃去上清液
，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中
，加入约 8ml 培养基，培养过夜）
。第二天换液并 检查细胞密度
。
2）细胞传代
：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。      
1. 弃去培养上清，用不含钙

、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中
，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟
，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分 变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化

。  
3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中
。
3）细胞冻存
：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类
；
1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，细胞变圆 脱 落后
，加入 1ml 含血清的培养基终止消化
，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加 入血 清和 DMSO
，轻轻混匀
，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml
，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液
，注意冻 存管做好标识。
3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取
。

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