老哥俱乐部

使用方法:
一、样品 DNA 的制备
用自选方法提取 Cps DNA

。注意：DNA 纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素

。如果不能很好纯化样品 DNA，后面的 PCR 再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备 Cps 标准曲线（以 10-10E6 这 6 个 10 倍稀释度为例

。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照
，只提供没有传染性的、可以直接使用的 DN**段作为阳性对照
。
1. 标记 6 个离心管，分别为 6
，5，4
，3，2 和 1 号
。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用 TE 缓冲液或超纯水 10 倍梯度稀释到10E7 拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10E7拷贝/μL，建议每次稀释 10 倍，梯度稀释至 10E7 拷贝/μL）。
4. 在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的 Cps 阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。
5. 换枪头
，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中
，充分震荡 1 分钟，得 10E5拷贝/μL 的阳性对照

。
6. 换枪头，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中

，重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。
7. NC 管中不加任何阳性对照。
8. 从 1-6 号管中分别取 5 μL 和待测样品一起进行定量 PCR（见下步），每个样品做 3 次重复
。PCR 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 PCR Ct 值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。

参数规格
：

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集

、处理及保存方法
1. 血清
：使用不含热原和内毒素的试管
，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆
：EDTA
、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液
：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物
。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃

，避免反复冻融
，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
​
检测步骤
：
一
、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)
、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s
。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表
：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液

，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团
：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

间三联：230.3Between three
：33763 C18H14

3,5-二溴-4-吡：264.93,5- dibromo -4- pyridine formaldehyde：70201-42-2 C6H3Br2NO

丽春红BSLi Chunhong BS：556.48 C22H14N4Na2O7S2
：4196-99-0

5--8-羟喹啉：160.175- -8- two amino hydroxy quinoline hydrochloride：21302-43-2 C9H6N2O

丹参素钠Sodium heparin：220.1549C9H9NaO5
：67920-52-9

2,5-二-4,6-二氯嘧
：179.012,5- two -4,6- two：55583-59-0 C4H4Cl2N4

5,10,15,20-四(4-吡)-21H,23H-卟啉
：618.695,10,15,20- four (4-) -21H, 23H- porphyrin：16834-13-2 C40H26N8

1,2-二溴乙
：263.961,2- styrene dibromide：93-52-7 C8H8Br2

4-羰-四甲氧自由：170.234- - four methyl piperidine carbonyl oxygen free radical：2896-70-0 C9H16NO2

隐袭腐霉LAMP试剂盒人 AKR1B1 基因全长ORF克隆

人 ADAM15 ELISA配对抗体

人 NBR2 基因全长ORF克隆

小鼠 CD40L / TNFSF5 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签

人 USP7 / HAUSP 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

小鼠 CCL9 基因全长ORF克隆

大鼠 MAP1LC3B 基因全长ORF克隆

人 B7-H4 / B7S1 / B7x 人细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

人 VNN1 基因全长ORF克隆

人 CD48 / SLAMF2 / BCM1 ELISA配对抗体

甲型流感 H7N7 血凝素 (Hemagglutinin / HA) ELISA配对抗体

甲型流感 H7N9 (A/Hangzhou/3/2013) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) (变性)