老哥俱乐部

使用方法:
一、样品 DNA 的制备
用自选方法提取 Cps DNA。注意：DNA 纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品 DNA
，后面的 PCR 再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二
、制备 Cps 标准曲线（以 10-10E6 这 6 个 10 倍稀释度为例
。由于标准品浓度非常高
，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的 DN**段作为阳性对照
。
1. 标记 6 个离心管
，分别为 6，5，4，3，2 和 1 号

。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用 TE 缓冲液或超纯水 10 倍梯度稀释到10E7 拷贝/μL（注
：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10E7拷贝/μL
，建议每次稀释 10 倍

，梯度稀释至 10E7 拷贝/μL）。
4. 在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的 Cps 阳性对照(上步稀释所得)
，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。
5. 换枪头，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 10E5拷贝/μL 的阳性对照。
6. 换枪头
，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中，重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。
7. NC 管中不加任何阳性对照。
8. 从 1-6 号管中分别取 5 μL 和待测样品一起进行定量 PCR（见下步），每个样品做 3 次重复。PCR 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 PCR Ct 值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴
，绘制标准曲线。

参数规格
：

储存条件
：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清
：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激
，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA
、柠檬酸盐或肝素抗凝

。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液
：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物
。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃
，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
​
检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)
，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表
：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量
，加入一适当体积洁净离心管中
，充分混匀，10000rpm离心10s
，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号
。报告基团：设置为FAM。淬灭基团
：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

3-羟-N-甲分子式
：115.17英文名称：3- hydroxy -N- methyl piperidine
：3554-74-3分子量： C6H13NO

3,5-二氟硝分子式
：159.09英文名称：3,5- two：2265-94-3分子量
： C6H3F2NO2

溴甲酚绿英文名称：Bromocresol green分子式：698.01分子量： C21H14Br4O5S
：76-60-8

3-溴喹啉分子式：208.05英文名称：3- bromide：5332-24-1分子量
： C9H6BrN

四氯乙英文名称：Four vinyl chloride分子式：165.83分子量
： C2Cl4
：127-18-4

硫长春新碱英文名称：Vincristine sulfate分子式：923.04分子量
：C46H56N4O10·H2：2068-78-2

N-氨丙啡啉分子式

：144.21英文名称：N- aminopropyl morpholine：123-00-2分子量
： C7H16N2O

二甲砜分子式：94.13英文名称

：Two methyl group：67-71-0分子量： C2H6O2S

4-吡吡氯盐酸盐分子式
：229.11英文名称：4- pyridinyl pyridinium chloride hydrochloride：5421-92-1分子量： C10H10Cl2N2

足马杜拉分枝菌LAMP试剂盒大鼠 FGF1 基因全长ORF克隆

食蟹猴 BMP4 基因全长ORF克隆

人 CTSK 基因全长ORF克隆

食蟹猴 PVR / CD155 人细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

人 PPHLN1 基因全长ORF克隆

食蟹猴 LAMP2 人细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

人 LAIR2 / CD306 人细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

人 TNFRSF11B 基因全长ORF克隆 (表达载体), 带FLAG标签

人 PPARA 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签

人 TRAF1 基因全长ORF克隆

人 TNFRSF11B 基因全长ORF克隆

人 IL1F10 转录变体1 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签