ELISA操作步驟複雜 ，影響反應因素較多 ，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致 ，因此在定量測定中 ，每批測試均須用一係列不同濃度的參考標準品在相同的條件下製作標準曲線 。測定大分子量物質的夾心法ELISA ，標準曲線的範圍一般較寬 ，曲線最高點的吸光度可接近2.0 ，繪製時常用半對數紙 ，以檢測物的濃度為橫坐標 ，以吸光度為縱坐標 ，將各濃度的值逐點連接 ，所得曲線一般呈S形 ，其頭 、尾部曲線趨於平坦 ，較呈直線的部分是理想的檢測區域 。
 

　　E2檢測ELISA試劑盒變質的因素 ：
 

　　操作因素 ：
 

　　試劑盒操作步驟雜亂，操作不當將引起較大的差錯 。加樣 、溫育 、洗刷 、顯色 、比色 。
 

　　樣本因素 ：
 

　　標本攪擾要素包含內源性攪擾要素和外源性攪擾要素 ，前者包含類風濕因子 、補體 、異嗜性抗體 、本身抗體 、等 ，後者包含標本溶血 、標本被細菌汙染 、標本貯存時刻過長 、標本凝結不全 、冷凍標本的重複凍融等 。
 

　　試劑因素 ：
 

　　不同批次的ELISA試劑在製作進程中很難保證質量一致 ，即使是通過批批檢的項目其檢測成果也存在差異 ，因而必須挑選和訂購長批號的試劑 ，並保證保存條件 。嚴格執行這一規範可以防止因試劑批號改動而從頭建立質控體係及從頭評估試劑的雜亂進程 ，並且能夠保證成果的穩定性 ；關於效期短 、使用率低的試劑 ，應當小量分裝 ，每次使用則取分裝部分即可 ，防止重複凍融造成試劑的失效 。