（一）AP的底物
AP為磷酸酯酶
，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作為底物
，可製成片劑
，使用方便
。產物為黃色的對硝基酚
，在405nm波長處有吸收峰
。用NaOH終止酶反應後
，黃色可穩定一時間
。
AP也有發熒光底物（磷酸4-甲基傘酮）
，可用於ELISA作熒光測定
，敏感度較高於用顯色底物的比色法
。
（二）ELISA試劑盒HRP的底物
HRP催化過氧化物的氧化反應
，代表性的過氧化物為H2O2
，其反應式如下
：
DH2+H2O2D+H2O
上式中
，DH2為供氧體
，H2O2為受氫體
。在ELISA中
，DH2一般為無色化合物
，經酶作用後成為有色的產物
，以便作比色測定
。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)
、四甲基聯苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2-azino-di-(3-ethylbenziazobinesulfonate-6)]
。
OPD氧化後的產物呈橙紅色
，用酸終止酶反應後
，在492nm處有zui高吸收峰
，靈敏度高
，比色方便
，是HRP結合物zui常用的底物
。OPD本身難溶於水
，OPD·2HCl為水溶性
。曾有報道OPD有致異變性
，操作時應予注意
。OPD見光易變質
，與過氧化氫混合成底物應用液後更不穩定
，須現配置現用
。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分
，OPD可製成一定量的粉劑或片劑形式
，片劑中含有發泡助溶劑
，使用更為方便
。過氧化氫則配入底物緩衝液中
，有製成易保存的濃縮液
，使用時用蒸餾水稀釋
。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02%H2O2的應用液,隻需加入OPD後即可作為底物應用液
。
TMB經HRP作用後共產物顯藍色
，目視對比鮮明
。TMB性質較穩定
，可配成溶液試劑
，隻需與H2O2溶液混和即成應用液
，可直接作底物使用。另外
，TMB又有無致癌性等優點
，因此在ELISA中應用日趨廣泛
。酶反應用HCL或H2SO4終止後
，TMB產物由藍色呈黃色
，可在比色計中定量
，zui適吸收波長為405nm
。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感
，但空白值極低
，也為一些ELISA試劑盒所采用
。
另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenlypropionicacid,HPPA]
，經HRP作用後
，產物顯熒光
，可用熒光光度計測量
。用於ELISA的優點為可加寬定量測定的線性範圍
。
HRP對氫受體的專一性很高
，僅作用於H2O2
、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(ureaperoxide)
。H2O2應用zui多
，但尿素過氧化物為固體
，作為試劑較H2O2方便
、穩定
。試劑盒供應尿素過氧化物片劑
，用蒸餾水溶解後
，在底物緩衝液中密閉
、低溫（2～8℃）可穩定1年
。