檢測未知抗體的間接法

1.用包被緩衝液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml ，每孔加0.1ml ，4℃過夜 。
 
2.次日洗滌3次 。
 
3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌 。(同時做空白 、陰性及陽性孔對照)於反應孔中 ，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml ，37℃孵育30-60分鍾 ，洗滌,一遍用DDW洗滌 。
 
4. 加底物液顯色 ：於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml ，37℃10～30分鍾 。
 
5. 終止反應 ：於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml 。
 
6. 結果判定 ：可於白色背景上 ，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深 ，陽性程度越強 ，陰性反應為無色或極淺 ，依據所呈顏色的深淺 ，以“+” 、“-”號表示 。也可測O·D值 ：在ELISA檢測儀上 ，於450nm(若以ABTS顯色 ，則410nm)處 ，以空白對照孔調零後測各孔O·D值 ，若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍 ，即為陽性 。

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