抗原 、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行 ，每加入一種試劑孵育後 ，可通過洗滌除去多餘的遊離反應物 ，從而保證試驗結果的特異性與穩定性 。在實際應用中 ，通過不同的設計 ，具體的方法步驟可有多種 。即:用於檢測抗體的間接法 、用於檢測抗原的雙抗體夾心法以及用於檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA試劑盒間接法 。 

1. 包被 ：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩衝液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml 。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml ，4℃過夜 。次日 ，棄去孔內溶液 ，用洗滌緩衝液洗3次 ，每次3分鍾 。（簡稱洗滌 ，下同） 。 

2. 加樣 ：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中 ，置37℃孵育1小時 。然後洗滌 。（同時做空白孔 ，陰性對照孔及陽性對照孔） 。 

3. 加酶標抗體 ：於各反應孔中 ，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定後的稀釋度）0.1ml 。37℃孵育0.5～1小時 ，洗滌。 

4. 加底物液顯色 ：於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml ，小鼠ELISA試劑盒37℃10～30分鍾 。 

5. 終止反應 ：於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml 。 

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