膠體金蛋白製備操作方法
1.待標記蛋白溶液的製備 將待標記蛋白預先對0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過夜 ，以除去多餘的鹽離子 ，然後100 000g4℃離心1h，去除聚合物 。
2.待標膠體金溶液的準備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調膠體金液的pH值 。標記IgG時 ，調至9.0;標記McAb時,調至8.2;標記親和層析抗體時 ，調至7.6;標記SPA時 ，調至5.9~6.2;標記ConA時 ，調至8.0;標記親和素時 ，調至9~10 。
由於膠體金溶液可能損壞pH計的電板 ，因此 ，在調節pH時 ，采用精密pH試紙測定為宜 。
3.膠體金與標記蛋白用量之比的確定
(1)根據待標記蛋白的要求 ，將膠體金調好pH之後 ，分裝10管 ，每管1ml 。
(2)將標記蛋白(以IgG為例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩衝液做係列稀釋為5mg/ml~50mg/ml ，分別取1ml ，加入上列金膠溶液中，混勻 。對照管隻加1ml稀釋液 。
(3)5min後 ，在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液 ，混勻後靜置2h ，觀察結果 。
(4)結果觀察 ，對照管(未加蛋白質)和加入蛋白質的量不足以穩定膠體金的各管 ，均呈現出由紅變藍的聚沉現象;而加入蛋白量達到或超過zui低穩定量的各管仍保持紅色不變 。以穩定1ml膠體金溶液紅色不變的zui低蛋白質用量 ，即為該標記蛋白質的zui低用量 ，在實際工作中 ，可適當增加10%~20% 。
4.膠體金與蛋白質(IgG)的結合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調pH至9.0 ，電磁攪拌IgG溶液 ，加入膠體金溶液 ，繼續攪拌10min ，加入一定量的穩定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發生沉澱 。常用穩定劑是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD) 。加入的量:5%BSA使溶液終濃度為1%;1%聚乙二醇加至總溶液的1/10 。
5.膠體金標記蛋白的純化
(1)超速離心法:根據膠體金顆粒的大小 ，標記蛋白的種類及穩定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間 。
用BSA做穩定劑的膠體金-羊抗兔IgG結合物可先低速離心(20nm金膠粒用1 200r/min ，5nm金膠粒用1 800r/min)20min ，棄去凝聚的沉澱 。然後將5nm膠體金結合物用6 000g，4℃離心1h;20nm~40nm膠體金結合物 ，14 000g ，4℃離心1h。仔細吸出上清 ，沉澱物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3) ，將沉澱重懸為原體積的1/10 ，4℃保存 。如在結合物內加50%甘油可貯存於-18℃保存一年以上 。
為了得到顆粒均一的免疫金試劑 ，可將上述初步純化的結合物再進一步用10%~30%蔗糖或甘油進行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結合物 。
(2)凝膠過濾法:此法隻適用於以BSA作穩定劑的膠體金蛋白結合物的純化 。將膠體金蛋白結合物裝入透析袋 ，在矽膠中脫水濃縮至原體積的1/5~1/10 。再經1 500r/min離心20min 。取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝膠S-400)層析柱分別純化 。層析柱為0.8 cm×20cm ，加樣量為床體積的1/10 ，以0.02Mol/L PBS液洗脫(內含0.1%BSA ，0.05%NaN3 ，pH8.2者用IgG標記物) ，流速為8ml/h 。按紅色深淺分管收集洗脫液 。一般先濾出的液體為微黃色 ，有時略混濁 ，內含大顆粒聚合物等雜質 。繼之為純化的膠體金蛋白結合物 ，隨濃度的增加而紅色逐漸加深 ，清亮透明 ，zui後洗脫出略帶黃色的為標記的蛋白組分 。將純化的膠體金蛋白結合物過濾除菌 、分裝,4℃保存 。zui終可得到70%~80%的產量 。
6.膠體金蛋白結合物的質量鑒定
(1)膠體金顆粒平均直徑的測量:用支持膜的鎳網(銅網也可)蘸取金標蛋白試劑 ，自然幹燥後直接在透射電鏡下觀察 。或用醋酸鈾複染後觀察 。計算100個金顆粒的平均直徑 。
(2)膠體金溶液的OD520nm值測定:膠體金顆粒在波長510nm~550nm之間出現zui大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液(含1%BSA ，0.02%NaN3)將膠體金蛋白試劑作1︰20稀釋 ，OD520=0.25左右 。一般應用液的OD520應為0.2~0.4 。
(3)金標記蛋白的特異性與敏感性測定:采用微孔濾膜免疫金銀染色法(MF-IGSSA) 。將可溶性抗原(或抗體)吸附於載體上(濾紙 、硝酸纖維膜 、微孔濾膜) ，用膠體金標記的抗體(或抗原)以直接或間接染色法並經銀顯影來檢測相應的抗原或抗體 ，對金標記蛋白的特異性和敏感性進行鑒定 。
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