檢測步驟
一、檢測標本的收集和保存
用於ELISA測定的檢測標本zui為常用的是血清（漿）
，有時因為特定的檢測目的
，也用到唾液
、腦脊液
、尿液
、糞便等標本
。目前檢測上使用血清標本測定的標誌物一般有傳染性病原體的抗原和抗體
、腫瘤標誌物
、激素
、特種蛋白
、細胞因子和治療藥物等
。對用於激素和治療藥物測定的血清標本的收集
，要注意收集時間甚或體位有可能會對測定結果產生影響
。如可的鬆在早晨4～6點之間
，會有一峰值出現
：生長激素
、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發性方式釋放
，因此
，在測定此類激素時
，有必要在密切相連的時間間隔內采取數份血樣本
，以其中間值為測定值
。又如當從臥位變為站立位時，血清中腎素活性將出現明顯增高
。再如治療藥物的檢測
，應根據藥代動力學選擇服藥後的zui適時間抽血檢測。用於傳染性病原體的抗原和抗體
、腫瘤標誌物和特種蛋白等的檢測的血清標本的收集則沒有時間和體位方麵的影響
，隻是在處理和保存方麵要考慮以下幾個方麵
：
（1）要注意避免出現嚴重溶血
。血紅蛋白中含有血紅素基團
，其有類似過氧化物的活性
，因此
，在以HRP為標記酶的ELISA測定中
，如血清標本中血紅蛋白濃度較高
，則其就很容易在溫育過程中吸附於固相
，從而與後麵加入的HRP底物反應顯色
。
（2）樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細菌汙染
，一則細菌的生長
，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產生分解作用
；二則一些細菌的內源性酶如大腸杆菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作標記的測定方法產生非特異性幹擾
。
（3）冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反複凍融
。標本的反複凍融所產生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產生破壞作用
，從而引起假陰性結果
。此外
，凍融標本的混勻亦應注意
，不要進行劇烈振蕩
，反複顛倒混勻即可
。
（4）標本在保存中如出現細菌汙染所致的混濁或絮狀物時
，應離心沉澱後取上清檢測
。
（5）血清標本如是以無菌操作分離
，則可以在2～8℃下保存一周
，如為有菌操作
，則建議冰凍保存
。樣本的長時間保存，應在-70℃以下
。
二
、加血清樣本及反應試劑
在現在的中
，血清樣本的加入幾乎是*的要使用微量加樣器加入樣本的步驟
。使用微量加樣器加樣必須注意的關鍵點是
：加樣不可太快
，要避免加在孔壁上部
，不可濺出和產生氣泡
。加樣太快
，無法保證微量加樣的準確性和均一性
。加在孔壁上部的非包被區
，易導致非特異吸附
。濺出會對鄰近孔產生汙染
。出現氣泡則反應液界麵有差異
。試劑的加入在國產試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加
，除了要注意滴加的角度外
，滴加的速度也很重要
，滴加太快
，很容易出現重複滴加或加在兩孔之間的現象
，這樣就會在孔內的非包被區出現非特異吸附
，從而引起非特異顯色
。所以
，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性
，下次測定為陰性
，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致
。
三
、試劑準備
在臨床實驗室
，對試劑準備一般不太注意
，通常的做法是
，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用
，而忽略了這種做法有可能影響後麵溫育時間不夠的問題
，其直接的後果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性
。因此在ELISA測定中試劑的準備zui為關鍵的是
，在實驗開始前
，將試劑盒先從冰箱中拿出來
，在室溫下放置20分鍾以上後
，再進行測定
，以使試劑盒在使用前與室溫平衡
。這樣做的目的
，主要是為了在後麵的溫育反應步驟中
，能使反應微孔內的溫度能較快地達到所要求的高度
，以滿足測定要求
。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配製
，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量
。此外
，當試劑盒以OPD為底物時
，則底物溶液應在反應顯色前臨時配製
。
四
、溫育
溫育是測定中影響測定成敗zui為關鍵的一個因素
。ELISA作為一種固相免疫測定
，抗原抗體的結合反應在固相上進行
，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結合
，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間
。溫育所需時間與溫度成反比
，即溫度越高
，則所需時間相對較短
。zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫
，其次是43℃和2～8℃。