細胞感染有以下三種
:
(一)細胞準備
將狀態良好的目的細胞接種到24孔板
,使細胞濃度為 1×105/ml 細胞
,接種細胞數量因細胞的生長速度而略有不同
, 一般是保證第二天進行病毒感染的時候細胞匯合率介於 50%至70%之間
。
(二)病毒感染
1.感染細胞MOI 的測定MOI(Multiplicity of Infection
,感染複數)是指每個細胞感染的病毒數
,通常MOI 越高
,病毒整合到染色體的數量以及目的蛋白的表達量越高
。對於分裂活躍的細胞
,比如 Hela
、293 細胞
,MOI=1~3 時
,80%以上的細胞均表達目的基因
。而對於非分裂細胞
,比如原代細胞
,感染效率較低
。需要進行MOI梯度摸索實驗
,選擇適合的MOI 進行實驗。
2.感染步驟
按實驗需要將細胞鋪板(比如12孔板)
;細胞數以第2天密度約50%為宜
;37℃ 培養過夜
。
對於Polybrene 可施加的細胞
:準備*培養基和 Polybrene混合物
,Polybrene 終濃度為摸索得到的zui適終濃度
。移去培養基並添加 0.5 ml Polybrene/培養基混合物於每孔中(適用於24 孔板,其他孔板請相應調整體)
。
對於不適用 Polybrene 的細胞
,以上步驟省略
,直接進入下麵步驟
:
感染前
,從冰箱取出並在 37℃水浴中快速融化病毒
,吸去細胞原有培養基
,將病毒原液加入細胞中
,輕輕8字混勻
。感染後第二天(約12小時)
,吸去含病毒的培養液
,換上新鮮的*培養液
,繼續37℃培養
。感染後48小時
,對於帶 GFP報告基因的病毒
,可通過熒光顯微鏡觀測GFP表達效率
,對於攜帶 Puromycin抗性基因的病毒
,換上含適當濃度的 Puromycin 的新鮮*培養液
,篩選穩定轉導的細胞株
。