改良過碘酸鈉標記法製備酶標抗體

    HRP分子中與酶活性無關的糖基被過碘酸鈉氧化為醛基，再與蛋白的氨基形成Schiff堿 。為了防止酶蛋白的氨基與醛基發生自身偶聯 ，在標記前先用2 ，4-二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基 。酶與抗體的結合反應後 ，再加入硼氫化鈉還原成穩定的結合物 。

(1) 取HRP 5mg溶於0.2mol/L ，pH5.6醋酸鹽緩衝液1ml中 ，加入1%DNFB無水乙醇溶液0.1ml ，室溫下輕微攪拌1h ；

(2) 加入新鮮配置的0.1mol/L NaIO4 0.5ml ，此時溶液由原棕色變為墨綠色 ，置4℃放置30min ，此時溶液由原棕色變為墨綠色 ；

(3) 加入2.5%乙二醇1ml ， 室溫下輕微攪拌1h ，終止反應 ；

(4) 加入待標記的抗體5-10mg ， 用1.0mol/L ， pH9.5 C ，調節pH值至9.0 ；

(5) 混勻 ，置4℃過夜

(6) 加入硼氫化鈉溶液0.1ml ，混勻 ，4℃放置3h ；

(7) 對0.01mol/L ，pH7.4  ，4℃透析過夜 ，換液3次 ；

(8) 3000r/min離心30min ，去除沉澱物 ；

(9) 收集上清液即為酶標記 。

【注意事項】

(1) 在氧化HRP時 ，以pH5.6醋酸鹽緩衝液溶解酶為宜 。

(2) 一般認為氧化HRP 5mg ， NaIO4量以0.06mol/L 0.5ml為宜 ，不能低於0.015mol/L 0.5ml 。

(3) 氧化HRP時間以15-30min為宜 。

(4) 加入DNFB的目的是為了封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基 。

(5) 加入乙二醇的目的是終止反應 ；為便於在加入後調pH值 ，故乙二醇要用0.05mol/L C配製 。

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