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免疫染色的注意問題
點擊次數 :1071 更新時間 :2016-01-15

1.免疫染色可在塗片或組織切片上進行免疫染色 。首先 ,標記抗體與標本中抗原反應結合 。其次 ,用PBS吸取未結合成分 。zui後 ,直接觀察結果(免疫熒光直接法)或顯色後再用顯微鏡觀察(免疫酶直接法) 。在此基礎上發展出間接法 、多層法 ,雙標記法等各種方法 。在免疫染色中應特別注意增強特異性染色 ,減少或消除非特異性染色 。在各種免疫染色中都應注意以下幾個問題 :

(1)增強特異性染色方法

1)蛋白酶消化法 :目的是暴露抗原 ,增加細胞和組織通透性 ,使抗原抗體zui大限度結合 ,增強特異性染色和避免非特異性染色 。該法已廣泛用於各種免疫細胞化學染色 。常用蛋白酶有 、及等 ;酶消化時間和溫度因各種抗原對消化的敏感性不同 ,應根據酶活性通過預實驗確定 ,消化時間還與組織固定的時間有關 ,越陳舊固定組織所需時間越長 ,以37℃為宜 。

2)適宜的抗體稀釋度 :抗體濃度是免疫染色關鍵步驟 。濃度過高 ,抗體分子多於抗原決定簇 ,可導致抗體結合減少 ,產生陰性結果 。

3)溫育時間 :一般抗體溫育時間為30~60min ,必要時可4℃過夜 。溫育溫度常用37℃ ,也可在室溫中進行 。37℃可增強抗原抗體反應 ,適用於多數抗原染色 ,但應注意在濕盒中進行 ,防止切片幹燥而導致失敗 。

4)多層染色法 :對弱抗原可用直接法(雙層) 、辣根過氧化物酶一抗過氧化物酶(PAP)和抗一(ABC)法(j層) ,四層或五層PAP法或ABC法 ,或PAP和ABC聯合染色法等,可很大程度提高敏感性 ,獲得良好結果 。

5)其他增敏方法 :如微波處理法 、酪氨酰胺信號放大技術(tyramide signal smplmcation ,TSA)增敏方法以及免疫PcR方法等 。

(2)減少或消除非特異性染色的方法 :組織中,非抗原抗體出現的陽性染色稱為非特異性背景染色 ,zui常見原因是蛋白吸附於高電荷的膠原和結締組織成分上 。有效消除方法是在用*抗體前,加與製備*抗體相同的動物的非免疫血清(1 :20~l :5) ,封閉組織上帶電基團而除去與*抗體非特異性結合 。必要時加入2%~5%牛血清白蛋白 ,可進一步減少非特異性染色 ,作用時間為lO~20min 。

(3)顯色反應的控製 :免疫酶染色應注意 :1)成色質濃度和反應時間 。增加成色質的量和(或)增加底物反應時間 ,可增加反應產物強度 ,著色太深可減少反應時間 。2)過氧化物酶顯色時 ,H2O2濃度較大將使顯色反應過快而導致背景加深 ,過量H2O2可抑製酶活性 。

(4)複染 :根據所用實驗方法和呈現顏色不同 ,可選用適當複染方法 。如陽性結果呈紅色或棕色 ,則用蘇木素將核染成藍色 ,以便定位檢測 。

4.對照設對照目的在於tiEBIj陽性結果的特異性 ,排除非特異性結果 。主要針對*抗體對照 ,常用對照方法包括 :陽性對照 、陰性對照 、阻斷試驗 、替代對照 、空白對照 、自身對照和吸收試驗 。

5.免疫細胞化學結果判斷對免疫細胞化學結果判斷應注意幾點 :①準確判斷陽性和陰性 ,排除假陽性和假陰性結果 ,必須嚴格對照試驗 ,對新發現陽性結果 ,除有對照試驗結果之外 ,應進行多次重複試驗 ,並用幾種方法進行驗證 。②判定特異性染色和非特異性染色 :特異性反應產物常分布於特定部位 ,且在同一切片上呈現不同程度陽性染色結果 。而非特異性染色表現為無一定的分布規律 ,常呈某一部位成片的均勻著色 ,和周圍結締組織均無區別著色 ,或結締組織呈現很強的染色 ;常出現於幹燥切片邊緣 ,有由於過強刀痕或自製折疊的部位 ;在過大組織塊 ,中心固定不好也會造成非特異染色 。當非特異性染色和特異性染色同時存在時 ,過強的非特異性染色背景會影響對特異性染色結果的觀察和記錄 。

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