操作要點 ：

1）將培養基在37℃水浴鍋預熱 ；準備一個15mL無菌的離心管 ，加入8mL預熱培養基 。

2）將凍存細胞從液氮罐中取出 ，快速放入37℃水浴鍋中複溫（可準備一潔淨的燒杯 ，裝滿37℃的水 ，細胞凍存管取出後迅速放入燒杯內 ，再逐步轉移到水浴鍋中） 。輕輕晃動凍存管 ，使細胞能在1~2min內*解凍 ，使細胞能盡快通過易受損的溫度段（-5~0℃） 。注意凍存管管口不能沒入水中 ，BRL(大鼠肝細胞)避免引起汙染。

3）用75%酒精擦拭凍存管後再置於超淨台內 ，將管內細胞轉移至準備好的離心管內 ，輕輕吹打液體 ，使細胞均勻分散 ，降低DMSO濃度 ，吹打時避免產生氣泡 。用新鮮培養基洗管壁2次 ，均轉移至離心管內 。

4）800rpm離心5min ，棄上清 ，加入新鮮的培養基 ，吹打製成細胞懸液 。

5）將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內，補加適量的培養基 ，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻 ，放入溫箱內培養 。

6）第二天觀察細胞貼壁生長情況 ，換新鮮培養基以去除死細胞 。繼續培養 ，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代 。一般剛複蘇的細胞需經過2~3次傳代 ，細胞活力恢複後才能進行後續的實驗 。

運輸和保存 ：

視天氣狀況和運輸距離遠近 ，公司與客戶協商後選擇下述方式中的一種進行 。

1)1mL凍存細胞懸液裝於1.8ml的凍存管中 ，置於裝滿幹冰的泡沫保溫盒中進行運輸 ；收到細胞後請盡快解凍複蘇細胞進行培養，如無法立刻進行複蘇操作 ，凍存細胞可在-80℃的條件下保存1個月 。

2)T-25培養瓶充滿*培養基後進行常溫運輸 ；收到細胞後請鏡下觀察細胞生長狀態 ，如鋪瓶率超過85%請立即進行傳代操作 ，如懸浮的細胞較多 ，請將培養瓶至於培養箱中靜置過夜以幫助未死亡的懸浮細胞能夠再次貼壁 。

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