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IL-3 雞白介素3酶聯免疫試劑盒分光光度法
點擊次數 :491 更新時間:2022-07-20

  為了更好的使用elisa試劑盒 ,接下來為大家說一下elisa試劑盒的提純方法,希望以下介紹對大家有所幫助 。

IL-3 雞白介素3酶聯免疫試劑盒分光光度法 注意 :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定 。 試劑一 :液體×1瓶 ,4℃保存 。 試劑二 :粉劑×1瓶 ,4℃保存 。臨用前加10mL蒸餾水溶解 。 試劑三 :粉劑×1瓶 ,4℃避光保存。臨用前加入10mL試劑一,沸水溶解 。試劑四 :粉劑×1瓶 ,4℃保存 。臨用前加50mL蒸餾水溶解 。試劑五 :液體×1瓶 ,4℃保存 。 標準品 :液體×1支 ,0.25μmol/mL標準酪an酸溶液 ,4℃保存 。自備儀器和用品 : 可見分光光度計 、水浴鍋 、磁力攪拌器 、可調式移液槍 、1mL玻璃比色皿 、1.5mLEP管和蒸餾水 。產品說明 : NP在一定的溫度和中性pH條件下 ,催化水解蛋白質 。由於其安全無毒 、水解能力強 、作用範圍廣等特點 ,中性蛋bai酶常用於食品、飼料 、化妝品和營養保健品 。 中性條件下 ,NP催化酪蛋白水解產生酪an酸 ;在堿性條件下 ,酪an酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍 ;在680nm有特征吸收峰 。

操作過程 :

一 、粗酶液提取 :

1.組織:按照組織質量(g) :試劑一體積(mL)為1 :5~10的比例(建議稱取約0.1g組織 ,加入1mL試劑一)冰浴勻漿 ,8000g ,4℃離心10min ,取上清 ,即粗酶液 。2.血清或培養液 :直接測定 。 3.細菌、真菌 :按照細胞數量(104個) :試劑一體積(mL)為500~1000 :1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一) ,冰浴超聲波破碎細胞(功率300w ,超聲3秒 ,間隔7秒 ,總時間3min) ;然後8000g ,4℃ ,離心10min ,取上清置於冰上待測 。

二 、測定操作 : 1.分光光度計預熱30min ,調節波長到680nm ,蒸餾水調零 。2.試劑二 、試劑三和試劑四置於30℃水浴保溫30min 。 3.對照管 :取一支EP管 ,加入100μL粗酶液 ,200μL試劑二 ,混勻後置於30℃水浴保溫10min ;加入200μL試劑三 ,混勻後8000g ,4℃離心10min ;取200μL上清液 ,加入新的EP管 ,再加入1000μL試劑四 ,200μL試劑五 ,混勻後置於30℃水浴保溫20min ,於680nm測定光吸收 ,記為A對照管 。 4.測定管 :取一支EP管 ,加入100μL粗酶液 ,200μL試劑三 ,混勻後置於30℃水浴保溫10min ;加入200μL試劑二 ,混勻後8000g ,4℃離心10min ;取200μL上清液 ,加入新的EP管 ,再加入1000μL試劑四 ,200μL試劑五 ,混勻後置於30℃水浴保溫20min ,於680nm測定光吸收 ,記為A測定管。(注意與空白管不同 ,先加試劑三 ,後加試劑二) 5.空白管 :取EP管 ,加入200μL蒸餾水 ,1000μL試劑四 ,200μL試劑五 ,混勻後置於30℃水浴保溫20min ,於680nm測定光吸收 ,記為A空白管 。 6.標準管 :取EP管 ,加入200μL標準品 ,1000μL試劑四 ,200μL試劑五 ,混勻後置於30℃水浴保溫20min ,於680nm測定光吸收 ,記為A標準管 。注意 :空白管和標準管隻需要測定一次 。

NP酶活性計算 :

(1)按蛋白濃度計算 NP活性單位(U)定義 :30℃每毫克蛋白每分鍾水解產生1μmol酪an酸為一個酶活單位 。NP活性(U/mgprot)=C標準品×△A測定÷△A標準×V1÷(Cpr×V2)÷T =0.125×△A測定÷△A標準÷Cpr 

(2)按樣本鮮重計算 NP活性單位(U)定義 :30℃每克樣品每分鍾催化水解產生1μmol酪an酸為一個酶活單位 。NP活性(U/g鮮重)=C標準品×△A測定÷△A標準×V1÷(W×V2÷V3)÷T =0.125×△A測定÷△A標準÷WC標準品 :標準酪an酸溶液濃度 ,0.25μmol/mL ;Cpr :粗酶液蛋白質濃度 ,mg/mL ;W :樣品鮮重 ,g ; V1 :酶促反應總體積 ,0.1mL ;V2 :加入反應體係中粗酶液體積 ,20µL=2×10-2mL ;V3:粗酶液總體積 ,1mL ; T :催化反應時間 ,10min 。 注意 :若反應較弱 ,(A測定管-A對照管)差值較小 ,可適當延長反應時間(20-30min) ,即第一步水浴時間 ,最後計算酶活時對公式進行修改 。


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