操作流程如下:

(1)待測樣品孔中每孔加入待測樣品100μl,每種樣品設3個平行孔;設兩個陰性對照孔,每孔加未處理組的細胞裂解液100μl;另設一個空白對照孔,加入純細胞裂解液100μl 。 

(2)酶標板置4℃,包被過夜 。

(3)洗板:吸幹孔內反應液,用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔後,即甩去),之後將洗滌液注滿板孔,浸泡1-2分鍾,間歇搖動 。甩去孔內液體後在吸水紙上拍幹 。重複洗滌3-4次 。

(4)陰性對照孔每孔加入PBS 50μl,樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的兔抗人AIF抗體工作液50μl 。 

(5)酶標板置37℃培養箱的濕盒內,孵育60min 。 

(6)洗板,同(4) 。 

(7)每孔加1:5000稀釋的HRP-標記的山羊抗兔抗體工作液 100μl 。 

(8)酶標板置37℃培養箱的濕盒內,孵育60min 。 

(9)洗板,同(4) 。 

(10)每孔加TMB顯色液 100μl,輕輕混勻10s,置37℃暗處反應15-20min 。 

(11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應 。 

(12)分別測450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2,最終測得的OD值為兩者之差(W1-W2),以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光幹擾。產品僅用於科研

(13)數據處理:在得出標本(S)和陰性對照(N)的 OD值後,計算S/N值 。S/N≥2.1為陽性判定標準 。

 

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